紫芝倍半萜合酶GsSTPS2可溶性表達條件的探索*

衛倩鶴，王齊，曹瑞，王麗芝，王海英

（天津中醫藥大學，天津 301617）

中藥靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum （Leyss.ex Fr.）Karst. 或紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子實體，性平，味甘；歸心、肺、肝、腎經，具有補氣安神，止咳平喘等功效，在中國具有2000多年的藥用歷史[1-2]。靈芝中除含有三萜、多糖、甾醇、核苷類等化學成分外，還含有豐富的倍半萜類化合物[3]。倍半萜是一類由3個異戊二烯單元組成的化合物，由倍半萜合酶以法尼基焦磷酸（FPP）為底物催化生成[4]。真菌中的一些倍半萜類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗蟲、植物生長調節、免疫調節等生物活性[5-6]，研究真菌的倍半萜合酶對于開發其倍半萜化合物具有重要意義。靈芝作為中國著名的藥用真菌之一，陳士林等已對其進行了基因組測序和注釋[7-8]。這為靈芝倍半萜合酶家族的功能研究提供了基礎。目前關于靈芝倍半萜合酶家族的功能驗證實驗還比較少[9-12]，因此進一步挖掘新的紫芝倍半萜合酶基因并進行功能驗證實驗，對研究紫芝體內倍半萜生物合成途徑，開發紫芝體內新的活性倍半萜產物具有重要意義。前期研究發現紫芝倍半萜合酶GsSTPS2可催化生成異香葉醇，該化合物具有殺白蟻、抗蠕蟲和植物生長調節作用，有良好的應用價值和前景。但同時發現GsSTPS2的可溶性較差，分離純化較為困難，這有礙于該酶的進一步開發應用。因此，本研究篩選了不同表達載體及表達菌株，并對其菌體密度、表達溫度、時間及IPTG誘導濃度進行了優化，以期獲得重組紫芝倍半萜合酶GsSTPS2蛋白可溶性表達的最佳條件，為靈芝倍半萜高效酶的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種和質粒 紫芝菌種5.69購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）。DH5α感受態細胞和Rosetta（DE3）感受態細胞購自天根公司。pGEM-T Easy載體購自普洛麥格公司，pET28a和pET32a空載體由本實驗室保存。

1.1.2 試劑 百泰克公司的通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）；寶日醫公司的PrimeScriptTMcDNA第一鏈合成試劑盒、Pyrobest DNA聚合酶、DNA A-Tailing試劑盒、T4 DNA連接酶、Hind Ⅲ限制性內切酶、BamH Ⅰ限制性內切酶；凱杰公司的QIAquick PCR純化試劑盒；天根公司的Taq聚合酶預混液、質粒小提試劑盒（離心柱型）；凱基生物公司的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液；索萊寶公司的氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、IPTG溶液（50 mg/mL）；默克公司的DVB/CAR/PDMS復合萃取頭（50/30 μm）；哲斯泰公司的20 mL頂空瓶。

1.2 方法

1.2.1 紫芝倍半萜合酶GsSTPS2的生信分析 使用Basic Local Alignment Search Tool在線網站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 對 GsSTPS2進行Protein BLAST分析。使用NCBI Conserved Domain Search 在線網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行GsSTPS2的蛋白質保守結構域分析。使用Euk-mPLoc 2.0在線工具（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）對GsSTPS2進行亞細胞定位預測。使用SignalP 4.0 Server在 線 工 具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）對GsSTPS2進行信號肽預測。使用TMHMM Server v.2.0在線工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對GsSTPS2進行跨膜結構域的預測。使用SOPMA在線工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）對GsSTPS2的蛋白二級結構進行預測分析。使用I-TASSER在線工具（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/） 對 GsSTPS2的蛋白三級結構進行預測分析。使用MEGA-X軟件構建系統發育樹。

1.2.2 紫芝倍半萜合酶GsSTPS2的克隆與重組克隆質粒的構建 本實驗基于紫芝基因組（GCA_002760635.1）的注釋結果獲得紫芝倍半萜合酶GsSTPS2的cDNA序列。活化紫芝菌種后，將其接種于PDA液體培養基中于25℃條件下暗培養7～10 d，而后收集紫芝菌絲提取總RNA并反轉錄成cDNA。使用引物對 GsSTPS2_F（5’-CCGGATCCAT GTCGGATAACTCGGAGAACAT-3’）和 GsSTPS2_R（5’-GGAAGCTTAACCTGCTCAAGTTCCTCGATC-3’）通過PCR技術以紫芝菌絲體cDNA為模板擴增GsSTPS2的全長。PCR程序為94℃預變性3 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，共30個循環，72℃延伸5 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶后，對目的基因末端進行加A操作，接著將其連接在pGEM-T Easy載體上并轉入大腸桿菌DH5α細胞中，通過菌落PCR篩選陽性轉化子進行sanger測序，最終獲得含有正確目的基因序列的重組質粒。

1.2.3 重組大腸桿菌表達載體pET28a-GsSTPS2的構建及其在大腸桿菌BL21（DE3）中的異源表達使用限制性內切酶HindIII和BamHI對重組克隆質粒和pET28a空質粒進行雙酶切操作。經膠回收操作后，將GsSTPS2基因片段連接到pET28a載體片段上。將重組表達質粒轉入DH5α細胞中，通過菌落PCR法挑取陽性轉化子并測序，提取正確的重組大腸桿菌表達質粒pET28a-GsSTPS2。分別將重組表達質粒pET28a-GsSTPS2和pET28a空質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中，于37℃條件下培養12～16 h。挑取陽性轉化子于LB液體培養基（含25mg/L的卡那霉素）中過夜振蕩培養，取200μL菌液轉接至10 mL新鮮LB培養基中繼續培養，當菌液的OD600為0.5左右時，向其中加入IPTG溶液使其終濃度為0.5 mmol/L，在37℃，220 rpm條件下培養4 h。取2 mL誘導培養完成的菌液進行離心操作并收集菌體，加入稀釋好的1×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液于沸水浴中煮沸10 min，最后通過SDSPAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況。

1.2.4 重組大腸桿菌表達載體pET32a-GsSTPS2的構建及其在大腸桿菌Rosetta（DE3）中的異源表達通過雙酶切操作將GsSTPS2片段從pET28a載體上更換至pET32a載體上，而后轉入大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態細胞中，于37℃條件下培養12～16 h。挑取陽性轉化子于LB液體培養基（含50 mg/L的氨芐青霉素和30 mg/L的氯霉素）中過夜振蕩培養，而后吸取200 μL菌液至10 mL新鮮的含抗性的LB培養基中繼續培養至OD600為0.5左右，向其中加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG溶液，在37℃，220 rpm條件下誘導培養4 h。經蛋白處理操作后，使用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況。

1.2.5 重組蛋白表達條件的優化 菌體密度OD600對GsSTPS2表達的影響。將含重組質粒pET32a-GsSTPS2的大腸桿菌Rosetta（DE3）接種在含抗性的LB液體培養基中過夜培養，而后以2%的接種量轉接至新鮮培養基，在37℃，220 rpm的條件下繼續培養至OD600分別為0.5，0.8和1.0，此時加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，在30℃，220 rpm的條件下誘導培養4 h。

誘導溫度對GsSTPS2表達的影響。細菌培養方法同上，當OD600為0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的 IPTG，分別在37℃，30℃，25℃，18℃，220 rpm的條件下誘導培養4 h。

誘導時間對GsSTPS2表達的影響。細菌培養方法同上，當OD600為0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，分別在18℃，220 rpm的條件下誘導培養0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，16 h，20 h，24 h。

“我最親愛的父親：你最近曾問我，為什么我聲稱在你的面前我感到畏懼。像以往一樣，我不知道該怎么回答你，這一部分正是出于我對你的畏懼……”[4]461-501這是1919年卡夫卡給他父親寫的那封著名的長信的開頭，這封長信淋漓盡致地表達了卡夫卡一直沉郁在自己心頭的復雜的“父親情節”。

IPTG終濃度對GsSTPS2表達的影響。細菌培養方法同上，當OD600達到0.8時，分別加入不同體積的 IPTG 溶液使其終濃度為 0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0 mmol/L，在18℃，220 rpm的條件下誘導培養12 h。

對上述不同培養條件下獲得的產物依次進行超聲破碎，離心，煮沸等操作，分別上樣上清和沉淀樣品進行SDS-PAGE電泳，而后使用Image Lab 5.2.1軟件對獲得的PAGE膠圖進行分析和相對定量，確定最適OD600、最適誘導溫度、最適誘導時間和最適IPTG終濃度。

1.2.6 HS-SPME-GC-MS分析 挑選3個陽性轉化子按照1.2.5優化出的最適條件進行誘導培養，取誘導培養完成的菌液于4℃，5 000 rpm的條件下離心20 min，吸取10 mL上清培養液至20 mL頂空樣品瓶中，此即為重組大腸桿菌代謝物的HSSPME-GC-MS分析樣品。采用DVB/CAR/PDMS固相微萃取萃取頭（50/30 μm，Supelco）萃取揮發性成分，然后由MPS-7890B-7000D（配置有多功能采樣器MPS的GC-MS分析系統）完成分析。MPS自動萃取程序為50℃靜置孵育20 min，萃取15 min，250℃脫附5 min，萃取頭在萃取前和脫附后分別老化3 min，用于消除不同樣品間的交叉污染。色譜條件：毛細管柱為 HP-5ms 30 m×250 μm×0.25 μm。氦氣流速為1 mL/min。升溫程序為60℃保持2 min，然后以6℃/min升至250℃，最后在250℃保持3 min。在獲得質譜數據之前，溶劑延遲2 min。質譜條件：電離源為EI，MSD為70 ev，離子源溫度為230℃，揮發性化合物的掃描范圍為30～500 μm/z。

2 結果與分析

2.1 紫芝倍半萜合酶GsSTPS2的生信分析 基于紫芝基因組和轉錄組注釋信息，篩選出紫芝倍半萜合酶 GsSTPS2（GenBank 登錄號：MT584777.1），其開放閱讀框為1 071 bp，編碼356個氨基酸，計算分子量為40.47 kD，等電點為4.85。信號肽和跨膜結構域預測結果顯示，GsSTPS2沒有信號肽和跨膜結構域（圖1A，B）。亞細胞預測結果顯示，GsSTPS2定位于細胞質中。保守域預測結果顯示，GsSTPS2和Terpene_cyclase_nonplant_C1相似，且含有1個Isoprenoid-Biosyn-C1 superfamily的保守區，表明GsSTPS2具備倍半萜合酶的基本特征和功能（圖1C）。二級結構預測結果顯示，GsSTPS2的二級結構組成為α螺旋占58.71%，β轉角占2.53%，延伸鏈占6.74%，無規卷曲占32.02%（圖1D）。GsSTPS2的三級結構預測結果如圖1E所示，該模型具有良好的質量（C-score值為0.03），其結構與4okmA（蛇床二烯合酶）的結構相似度最高。

圖1 GsSTPS2的生物信息學分析

2.2 紫芝倍半萜合酶GsSTPS2的克隆和克隆載體的構建 如圖2A所示，PCR擴增獲得大小在1000bp左右的條帶，這與GsSTPS2的cDNA序列大小一致。對測序正確的陽性轉化子進行提質粒操作，如圖2B所示，提取的質粒大小均在5 000 bp以上，與目的重組克隆質粒pGEM-T Easy-GsSTPS2大小一致。

圖2 GsSTPS2基因的克隆和克隆載體的構建

2.3 紫芝倍半萜合酶GsSTPS2在大腸桿菌中的蛋白表達 如圖3A所示，以pET28a空載體作為陰性對照，GsSTPS2在35-48kD間無明顯蛋白條帶，表明目的蛋白在BL21（DE3）中沒有表達或表達量很低。如圖3B所示，以pET32a空質粒為陰性對照，GsSTPS2在Rosetta（DE3）中有明顯蛋白表達。GsSTPS2的蛋白分子量約為40 kD，Trx蛋白和His蛋白的分子量約為23 kD，GsSTPS2-His-Trx融合蛋白分子量在63 kD左右，符合預期大小。

圖3 GsSTPS2的SDS-PAGE電泳圖

2.4.1 菌體密度OD600對GsSTPS2表達的影響 如圖4A所示，GsSTPS2的總蛋白表達量隨著OD600的增加而持續增加，當OD600為1.0時達到最大。GsSTPS2的可溶性蛋白表達量隨OD600的增加呈現出“先增加后減少”的趨勢，當OD600為0.8時可溶性表達量達到最大，占上清總蛋白的17.62%。

圖4 菌體密度OD600和誘導溫度對GsSTPS2表達的影響

2.4.2 誘導溫度對GsSTPS2表達的影響 如圖4B所示，GsSTPS2的總蛋白表達量隨溫度降低呈現“先增加后減少”的趨勢，當溫度為30℃總蛋白表達量最大。GsSTPS2的可溶性蛋白表達量隨溫度降低而逐漸增加，當溫度為18℃時可溶性表達量達到最大，占上清總蛋白的20.08%。

2.4.3 誘導時間對GsSTPS2表達的影響 如圖5A所示，隨培養時間的延長，總蛋白表達量呈現“先增加后減少再增加”的趨勢，在培養時間為24 h時表達量最高；可溶性蛋白的表達量呈現“先增加后減少再增加再減少”的趨勢，在12 h可溶性表達量最高，占上清總蛋白的24.48%。

圖5 誘導時間和和IPTG終濃度對GsSTPS2表達的影響

2.4.4 IPTG終濃度對GsSTPS2表達的影響 如圖5B所示，隨IPTG終濃度的增高，GsSTPS2總蛋白表達量呈現“先增加再減少再增加再減少”的趨勢，當IPTG終濃度為0.5 mmol/L時總蛋白表達量最高。當IPTG終濃度為1.0 mmol/L時GsSTPS2的可溶性蛋白表達量最高，占上清總蛋白的28.07%。此外，不含有IPTG的大腸桿菌內源性蛋白表達量比含有IPTG的大腸桿菌內源性表達量高，表明添加IPTG不僅可以啟動目的蛋白表達，還可以抑制內源性蛋白的表達。

2.5 GsSTPS2在大腸桿菌體內的催化產物鑒定 通過比對實驗獲得的揮發性產物的質譜數據和NIST MS Search 2.3（2017版）中標準化合物的質譜數據來分析鑒定GsSTPS2在大腸桿菌體內的催化產物，其中化合物4通過與δ-杜松烯標準品比對進行進一步的鑒定。如表1和圖6所示，以pET32a空質粒為陰性對照，對GsSTPS2重組大腸桿菌代謝產物進行分析，檢測到4個分子量為204 m/z的倍半萜碳氫化合物和3個分子量為222 m/z的倍半萜含氧衍生物，其中化合物4（δ-杜松烯）、化合物5（異香葉醇）和化合物6（蓽澄茄油烯醇）的響應值較高，化合物 1（杜松-3，5-二烯）、化合物 2（β-杜松烯）、化合物 3（順-衣蘭油-4（15），5-二烯）和化合物 7（τ-依蘭油醇）的響應值較低。

表1 GsSTPS2的大腸桿菌代謝物鑒定

圖6 GsSTPS2催化產物的HS-SPME-GC-MS分析

2.6 系統發育分析 SWISS-PROT數據庫收錄的是EMBL核酸序列數據庫中經過注釋和校對的蛋白質序列[13]，將GsSTPS2與SWISS-PROT數據庫的蛋白質序列進行BLAST分析，發現GsSTPS2與來自毛韌革菌（Stereumhirsutum）、灰蓋鬼傘（Coprinus cinereus）、茶樹菇（Agrocybeaegerita）、褐腐菌（Postia placenta）這4個擔子菌的倍半萜合酶相似度較高。將GsSTPS2的氨基酸序列與來自上述4個擔子菌的倍半萜合酶及已功能驗證過的17個赤芝倍半萜合酶和其他5個紫芝倍半萜合酶進行系統發育分析發現，所有的倍半萜合酶序列聚類為5支（圖7），Grayson T.Wawrzyn等人基于真菌倍半萜合酶氨基酸序列建立的系統發育樹同樣聚為5支[14]。在這6個擔子菌中，紫芝的倍半萜合酶與赤芝的倍半萜合酶親緣關系最近。17個赤芝倍半萜合酶在5個分支中均有分布，目前已功能驗證的5個紫芝倍半萜合酶分布在進化枝Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ中，GsSTPS2聚類在第Ⅲ支，且與GL20733的親緣關系最近。此外，GsSTPS2的產物與GL20733的產物也具有相似的化學結構[9]，其中蓽澄茄油烯醇與庫貝醇互為立體異構體，τ-依蘭油醇與α-畢橙茄醇、α-衣蘭油醇和τ-畢橙茄醇互為立體異構體，這表明了基于氨基酸序列的系統發育分析在預測酶促反應機制和終產物結構方面的潛力。

圖7 GsSTPS2與其他功能性擔子菌倍半萜合酶的系統發育分析

3 討論

3.1 目的基因的異源表達受載體和菌株的影響 蘭艷平等人將棉花去泛素化酶基因GhOTUD5構建在pET-22b載體上并轉入大腸桿菌細胞中，發現目的基因在 BL21（DE3）中不表達，在 Transetta（DE3）菌株中成功表達[15]。本研究首先將GsSTPS2基因連接到了常用的pET28a載體上并轉入BL21（DE3）細胞中，發現沒有目的蛋白表達。接著將目的基因更換至pET32a載體上并轉入Rosetta（DE3）中，實現了異源表達。這些結果均表明基因在大腸桿菌中的異源表達與載體和菌株密切相關。在實驗初期，根據基因特性選擇合適的菌株和載體，并考慮菌株和載體的適配性，將促進外源基因在大腸桿菌中的成功表達。如pET32a載體含有Trx基因，可以促進靶蛋白的可溶性表達；Rosetta（DE3）株含有稀有密碼子，能夠提高真核基因在大腸桿菌中的表達水平。

3.2 優化誘導條件可促進目的蛋白的可溶性表達 真核基因在原核表達系統中表達水平的高低與除了與原核表達質粒、宿主菌的類型有關外，還與誘導目的蛋白表達的條件等有關[16]。為了提高GsSTPS2的可溶性蛋白的表達量，我們采用不同菌體密度、誘導溫度、誘導時間及IPTG終濃度對重組蛋白進行了培養，對比分析獲得了GsSTPS2的最佳誘導條件：初始菌液OD600為0.8，誘導溫度為18℃，誘導時間為12 h，IPTG終濃度為1 mmol/L，并采用最優條件進行重組大腸桿菌的誘導與培養，而后采用HS-SPME-GC-MS法對培養基中的揮發性成分進行鑒定與分析。與其他3種條件相比，降低溫度是促進外源基因可溶性表達的最關鍵條件。高溫誘導時，大腸桿菌的生長速度加快，蛋白合成速度也隨之加快，目的蛋白來不及進行正確折疊，從而形成沒有活性的包涵體。陳德鑫等[17]對煙草NteIF2α（真核翻譯起始因2α）基因表達中發現，37℃誘導時該基因形成包涵體，當誘導溫度降低至16℃時，該基因形成了一定的可溶性蛋白，該研究結果進一步支持了降低溫度有利于目的蛋白可溶性表達的觀點。

3.3 倍半萜高效合成酶的挖掘對開發新的倍半萜化合物具有重要意義 倍半萜類化合物具有豐富的碳氫骨架和生物活性，是一類重要的次級代謝產物[18-19]。倍半萜合酶作為其生物合成中的關鍵酶，具有重要的研究價值。在高等真菌中，擔子菌具有比子囊菌更為豐富的倍半萜合酶基因，每個擔子菌體內均含有幾種到幾十種不等的倍半萜合酶[20-21]。目前除靈芝外，僅有極少數的擔子菌倍半萜合酶家族完成了功能驗證研究，如茶樹菇[22]、毛韌革菌[23]、灰蓋鬼傘[24]、褐腐菌[14]、發光臍菇（Omphalotusolearius）[25]、Clitopilus pseudo-pinsitu[26]等，未來仍需對更多的擔子菌倍半萜合酶家族進行相關研究。此外，已發現多種擔子菌倍半萜合酶具有催化生成重要生物活性化合物的能力。隱杯傘素具有明顯的抗癌活性，發光臍菇倍半萜合酶Omp6和Omp7可催化生成隱杯傘素的前體Δ6-protoilludene[14]。擔子菌Lignosusrhinocerotis倍半萜合酶GME3638催化生成的主產物榧樹醇對乳腺癌細胞（MCF7）表現出強選擇性的細胞毒性[27]。異香葉醇作為GsSTPS2的主產物之一，具有殺白蟻、抗蠕蟲和植物生長調節作用[28-29]。采用代謝工程手段構建GsSTPS2的高產大腸桿菌菌株，將有助于實現更高效綠色的異香葉醇的合成。

本研究通過將紫芝倍半萜合酶GsSTPS2克隆到pET32a表達載體上并轉入Rosetta（DE3）細胞中實現了GsSTPS2在大腸桿菌中的高效異源表達，通過對不同誘導溫度、誘導時間及IPTG誘導濃度的比較分析獲得了GsSTPS2的最佳誘導條件：初始菌液OD600為0.8，誘導溫度為18℃，誘導時間為12 h，IPTG終濃度為1 mmol/L，使其可溶性表達由17.62%提高到28.07%。在此基礎上采用HS-SPMEGC-MS的方法鑒定了GsSTPS2的功能，其可催化生成倍半萜碳氫化合物δ-杜松烯、杜松-3，5-二烯、β-杜松烯和順-衣蘭油-4（15），5-二烯及倍半萜含氧衍生物異香葉醇，蓽澄茄油烯醇和τ-依蘭油醇。本研究開發了1種新的紫芝倍半萜合酶GsSTPS2，并針對其較差的可溶性進行了重組蛋白可溶性表達條件的探索，為進一步通過酶工程改造酶催化活性高效生產異香葉醇提供了數據支持，也為通過合成生物學方法生產異香葉醇奠定了基礎。