中藥活性成分對腫瘤細胞周期基因的調控作用

申倩，沈雨蕾，曾雪倩，李俊辰，張建嶺，龐博

（1.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053；2.北京中醫藥大學，北京 100029；3.上海中醫藥大學，上海 201203；4.天津中醫藥大學，天津 301617）

細胞周期分為分裂間期和分裂期（M期），其中分裂間期又可分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）[1-3]。G1期是細胞由靜止期（G0期）轉向細胞增殖周期的起點。S期時細胞內完成染色體DNA復制，形成兩條姐妹染色體單體。在G2期，合成有絲分裂所需的RNA和蛋白質等，為M期做準備。M期即有絲分裂期，又可以分為初期、前期、中期、后期和末期，最終分裂形成兩個基因相同的子細胞[1-3]。細胞周期是細胞增殖的核心環節，受到多種因素的調控和影響，如Ras-MAPK、PI3K、Wnt和 Notch[4-5]等細胞生長信號途徑，受刺激后可引起細胞由靜止期（G0期）進入增殖周期。在細胞周期中，細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（Cyclin-Dependent Kinase，CDK）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（Cyclin-dependent kinase inhibitors，CKI） 為生物細胞周期過程中的3類核心調控分子[6]。

Cyclin（CyclinA-T）、CDK（CDK1-9）以及 CKI的兩大家族 INK4（p15、p16、p18 和 p19） 和 CIP/KIP（p21、p27和p57）[7]均在細胞周期的不同階段表達不同的蛋白分子，其進一步在激活和失活中相互轉換，從而使得細胞周期順序進行（圖1）。在細胞周期各階段中，兩大家族的成員形成不同的Cyclin-CDK蛋白激酶復合物。Cyclin-CDK蛋白激酶復合物在細胞周期的特定階段、特定時間點形成和激活，CDK磷酸化特定底物，啟動與細胞周期有關基因的轉錄。這個過程是細胞通過不同的細胞周期階段尤其是G1/S和G2/M檢查點必不可少的，對細胞周期各階段的完成以及進入下一個階段起關鍵和決定性作用，是細胞周期各階段中最突出的生物學標志性事件[3]。見圖1。CKI常與蛋白激酶復合物結合而抑制其活性，從而抑制或阻止細胞周期的進程[8]。目前研究顯示，幾乎所有的人類腫瘤細胞均存在Cyclin、CDK和CKI基因的突變、擴增和/或表達的異常，在調控細胞周期檢查點中起重要作用的p53和pRb信號途徑也存在50%以上基因結構的異常[9]。這些結構的異常使得細胞周期和細胞凋亡的調控解除或檢查點失能，進一步使攜帶缺陷基因的細胞因不能被及時阻滯和凋亡，造成持續的細胞周期循環和損傷基因富集，最終使得細胞轉化為腫瘤細胞，并無限增殖[10-12]。從某種程度上來說，細胞周期基因的調控在開啟或關閉腫瘤細胞生死的過程中起至關重要的作用[13]。因此，針對細胞周期基因分子靶點的調控是目前抗癌藥物研究的熱點。本文就近年來國內外關于直接調控細胞周期基因分子表達而影響腫瘤細胞周期，具有抑制腫瘤細胞增殖，甚至殺傷腫瘤細胞的多種中藥活性成分的研究進行梳理、綜述。

圖1 中藥活性成分調節癌細胞周期Cyclin、CDK和CKI基因表達，阻滯細胞周期進展

1 DNA合成前期（G1期）

在G1期前期，細胞生長信號持續刺激CyclinD基因[基因家族：CCND1（11q13.3）、CCND2（12q13.32）、CCND3（6q21.1）]，使其大量表達并與 CDK4（CDK4，12q4.1）或 CDK6（CDK6，7q21.2）結合，誘導 CyclinDCDK4/CDK6復合物活化[14]。在G1后期，CyclinE基因[基因家族：CCNE1（19q12）、CCNE2（8q22.1）]開始高表達，與 CDK2（CDK2，12q13.2）結合后，在 S 期初期達到最大值，促進細胞周期通過G1/S檢查點由G1 期轉入 S 期[3，6，14]。在 G1 期，INK4 家族成員能夠抑制CyclinD-CDK4/6復合物，使得細胞周期阻滯于 G1/S 期[5]。

Wang等[15]探究補骨脂素對于人肝癌細胞SMMC7721的作用機制，發現補骨脂素能夠調節CyclinD1和CyclinE的表達，使其內質網和細胞質結構異常，導致細胞周期被阻滯于G1期，從而抑制肝癌細胞的增殖。Zhang等[16]的實驗研究表明，重樓皂苷通過使CDK2表達下降，p21（Cyclin dependent kinase inhibitor 1A，p21，6q21.3）表達升高來抑制人非小細胞肺癌A549的生長。Li[16]等人通過斑蝥素對人表皮樣癌細胞A431及其移植小鼠模型的細胞毒性作用實驗發現斑蝥素可顯著降低細胞中CyclinE、CDK6和CyclinD的蛋白表達水平，誘導細胞在G0/G1期阻滯，從而降低人表皮樣癌細胞A431存活率，誘導細胞凋亡。王斌等[18]的研究發現黃連總生物堿聯合運動能夠下調原位移植4T1乳腺癌小鼠腫瘤細胞 CDK4、CDK6、cyclinD1、CDK2 和 cyclinE蛋白的表達水平，從而使細胞阻滯于G1/S期。樊帥軍等[19]發現，漢黃芩素通過降低CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4蛋白表達，同時使CIP/KIP家族的激酶抑制因子p21和p27蛋白表達升高將結腸癌細胞LoVo阻滯于G0/G1期。鐘偉楓等[20]的實驗結果顯示，龍葵素能抑制裸鼠前列腺癌細胞Du145移植瘤細胞 CyclinD1、CyclinE1、CDK2、CDK4 和 CDK6 的表達，促進p21的表達，從而調控細胞周期G1/S關卡抑制前列腺癌細胞裸鼠移植瘤的生長。侯新[21]等人的研究表明，苦豆堿能夠通過降低CyclinD1的表達，進而抑制宮頸癌細胞Hela的增殖。

G1期形成的Cyclin-CDK復合物能催化G1/S細胞周期進展的主要抑制性蛋白Rb磷酸化，使其與調節細胞周期進展和細胞增殖的重要轉錄因子E2F解離，從而阻斷其抑制E2F的活性，使細胞進入S期[24]。Rb-E2F是遏制外源性信號的“限制點”，因此，抑制G1期癌基因CyclinD、CyclinE、CDK4和CDK6的表達或增加抑癌基因p53（野生型）、p16、p18、p21和p27等表達可使癌細胞被阻滯于G1期，達到抑制細胞增殖，甚至誘導細胞凋亡的作用[5]，見圖1。

在探究柴胡皂苷-D抑制宮頸癌細胞Hela的分子機制時，劉志華等[22]的實驗發現，柴胡皂苷-D通過降低CyclinD1和CylcinE的表達，增加p53和p21表達，使得宮頸癌細胞Hela阻滯在G1期。Zhu等[23]發現，甘草次酸能夠顯著抑制CyclinD1、CyclinD3、CyclinE、CDK4、CDK6、CDK2 和 E2F-1 表達，并能上調非小細胞肺癌細胞A549和NCI-H460p16（Cyclindependent kinase inhibitor 2A，p16，9q21.3）、p18（Cyclindependent kinase inhibitor 2C，p18，1p32.3）、p21 和p27（Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B，p27，12p13.1）的表達。由于P16、p18、p21和p27均可競爭結合CDK4/6，使Rb磷酸化被抑制，因此甘草次酸能夠通過Rb/E2F通路發揮抑制作用，導致細胞的生長抑制。

中藥活性成分，重樓皂苷、斑蝥素、漢黃芩素、龍葵素、甘草次酸等對G1期相關基因具有調控作用，具有進一步研究和開發價值。

2 DNA合成期（S期）

S期最主要的Cyclin/CDK復合物是CyclinA/CDK2[CyclinA 基因家族：CCNA1（13q3.3），CCNA2（4q27）]，它能啟動DNA復制，產生兩條完全相同的姐妹染色體。從此期開始與外生長信號脫離，僅調節細胞周期內的調節基因的表達才可影響細胞周期的進展[2-7]。中藥活性成分，甘草查爾酮B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、補骨脂酚和淫羊藿苷等對S期基因具有調節作用。

實驗研究發現，甘草查爾酮B能夠通過降低S期cyclinA、CDK1及CDK2的mRNA表達誘導膀胱癌腫瘤細胞阻滯于S期[25]。周少荷[26]的研究顯示丹參酮Ⅰ通過使肝癌細胞7721中Cycline A1蛋白的表達量增少，p21的表達量增加，進而使Cyclin-CDK復合物不能有效形成，同時，CIP/KIP家族抑制蛋白p21高表達，促使細胞被阻滯在S期。周新強等[27]的實驗研究發現丹參酮ⅡA通過使食管癌細胞系Eca-109的S期檢查點的正向調控基因Cyclin A和CDK2蛋白表達降低，影響DNA復制，使細胞阻滯在S期。除此之外，簡曉順等[28]還發現丹參酮ⅡA可能通過上調P27抑制CDK2，導致非小細胞肺癌細胞NCI-H520阻滯于S期。張哲楠等[29]研究發現，補骨脂酚可誘導人乳腺癌細胞MCF-7產生活性氧，使p53和p21蛋白表達增加，通過p53/p21途徑，使得CDK2和CyclinA2表達減少，進而引起細胞阻滯于S期。有研究發現，淫羊藿苷可通過抑制髓母細胞瘤細胞中細胞周期相關蛋白cyclinA、CDK2、cyclinB1的表達誘導其在S期發生阻滯[30]。見圖1。

3 DNA合成后期（G2期）到分裂期（M期）

在 G2 期形成的 CyclinA-CDK1（CDK1，10q21.2）及晚期形成的CyclinB-CDK1[CyclinB基因家族：CCNB1（5q13.2，），CCNB2（15q22.2）]在促進 G2 到M期轉化中起著關鍵的作用[31]。CyclinB-CDK1又被稱為成熟促進因子，能夠轉入細胞核，磷酸化核內底物，進而調控有絲分裂[3-5]。負調節CIP/KIP家族的成員對細胞周期Cyclin-CDK復合物均具有重要的負調節作用[3-7]。因此，G2/M期在腫瘤的發生發展以及治療方面至關重要[32]。

Zhang等[33]的研究表明九里香堿可導致肺癌細胞A549被阻滯在G2/M期，其機制與藥物處理后CyclinD、CyclinE、CDK2、CDK4 和 CDK6 表達降低，而p21和p27表達升高有關。薯蕷皂苷元[34]在誘導肝癌細胞Bel-7721、SMMC-7721和HepG2生長抑制實驗中顯示，薯蕷皂苷元可引起細胞G2/M期阻滯，機制與上調p21和p27的表達有關。Meiyin Chang 等[35]發現芳樟醇通過引起 p53、p21、p27、p16和p18基因的過表達，從而抑制Cyclin-CDK的活性導致宮頸癌細胞HeLa在G2/M期停滯。Kim等[36]觀察紫草素對胃癌細胞AGS的細胞毒性作用，發現紫草素通過調控細胞中的p21基因，將細胞周期阻滯于G2/M期，從而抑制細胞增殖。Liu等[37]用吉瑪酮處理人肝癌細胞HepG2和Bel7402，結果顯示吉瑪酮下調CyclinB1和CKD1的表達，使細胞被阻滯于G2/M期。Liu等[38]將杜荊素化合物1用于黑色素瘤細胞的治療實驗中，發現其通過下調CDK1，CDK6，CyclinE和CyclinA的表達，上調p21的表達，使細胞阻滯于G2/M期。Li等[39]發現大戟甘能夠通過增加磷酸化CDK1（Tyr15）蛋白水平而誘導宮頸癌細胞HeLa的細胞周期阻滯于G2/M期。

苦杏仁苷對于多種晚期腫瘤都有很好的抑制作用。Shi等[40]的研究顯示苦杏仁苷通過抑制CDK1、CDK2、CDK4、CyclinA和CyclinB的表達使腎癌細胞周期阻滯在G2/M期，它也能通過抑制CDK1、CDK2、CDK4、CyclinA、CyclinB和 CyclinD3的表達，促進p19和p27的表達（抑制CDK活性），使前列腺癌的細胞周期阻滯在G2/M期。羅燕等[41]的研究顯示柴胡皂苷 D 可通過降低 CyclinA1、CyclinA2、CyclinB1、CyclinB2的蛋白和mRNA的表達，從而通過減少Cyclin-CDK蛋白激酶形成使乳腺癌細胞MDAMB-231阻滯于G2期。見圖1。

這些研究顯示，薯蕷皂苷元、芳樟醇、紫草素、苦杏仁苷、柴胡皂苷D等對G2期和M期基因具有調控作用，具有進一步研究和開發價值。

4 結語與展望

目前研究顯示：中藥活性成分主要通過調控抑制腫瘤細胞周期G1期的CyclinD-CDK4/6和CyclinE-CDK2，S 期 的 CyclinA-CDK2，G2 期 的CyclinA-CDK1以及M期的CyclinB-CDK1表達，升高 INK4家族的 p16、p18、p19和 CIP/KIP家族的p21、p27、p57的表達來阻滯腫瘤細胞的細胞周期。細胞周期受到高度精細調節，與其上游Ras-MAPK、PI3K、Wnt和Notch等多種癌基因信號途徑、p53/p21等多種抑癌基因信號途徑及其下游E2F等多種靶基因密切聯系。這些信號途徑的異常與Cyclin、CDK、CDKI家族基因突變、擴增或表達失控都是通過細胞周期而最終發揮“癌生物學”作用的，因此亟待針對細胞周期藥物的研究和開發。本文匯總、歸納了中藥活性成分對細胞周期Cyclin、CDK、CDKI家族基因及其表達的調控作用。研究顯示1種中藥活性成分可調節1-7種細胞周期基因（表1），涉及癌基因和抑癌基因的表達，其作用是明確的，但對細胞周期基因表達的精準調節機制以及其更深層次的相互關系還需要進一步梳理和明晰。目前，尚存在的另一個問題是，幾乎所有腫瘤都至少存在1項Cyclin、CDK和CKI基因突變或表達異常，但中藥活性成分對這些突變基因及異常表達基因的調控作用研究尚少，仍待開展研究和解析。綜上分析可以得出，藥物靶向作用于腫瘤細胞周期基因是控制腫瘤細胞生死，抑制其無限制增殖的末節核心開關，因此在此領域的中藥活性成分（如，斑蝥素、漢黃芩素、紫草素、苦杏仁苷等）藥效基因靶點研究是具有巨大潛力的研究領域，需要研究者不斷深入探索。