外周血Th9、Th22和Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子在過敏性鼻炎中的研究

李 志,楊婷婷,李文哲,王 波,薛邦祿

(1.大連市中心醫(yī)院 檢驗科,遼寧 大連116033;2.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,遼寧 大連116044)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)又稱變應(yīng)性鼻炎,是指某種變應(yīng)原接觸某些個體后,引起機體的免疫系統(tǒng)過度反應(yīng),進而對人體的氣道有不同程度損傷的非感染性炎性疾病。隨著空氣污染因社會發(fā)展而加重,加之全球氣候變化、人口增多、人員流動性增大,過敏性疾病的患病率逐年升高,造成人們的工作效率嚴(yán)重下降、生活狀態(tài)受到影響。2017年的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),世界范圍內(nèi)10%-40%的人口正在經(jīng)受過敏性鼻炎的困擾[1],AR在近幾年逐漸成為引起人們注意的一個重要疾病。近年來,許多的研究發(fā)現(xiàn),在過敏性疾病中,T淋巴細(xì)胞發(fā)揮不容忽視的作用,其中CD4+T淋巴細(xì)胞的變化最為明顯。在過敏性鼻炎中,Ⅰ型輔助性T細(xì)胞(Th1)、Ⅱ型輔助性T細(xì)胞(Th2)數(shù)量和功能的變化,以及主要細(xì)胞因子如伽馬干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)等維持著機體內(nèi)抑炎、促炎平衡。然而,隨著研究的逐步深入,發(fā)現(xiàn)Th9細(xì)胞、Th22細(xì)胞和Treg細(xì)胞等多種細(xì)胞及其主要細(xì)胞因子-白細(xì)胞介素-9(IL-9)、IL-22及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)對過敏性疾病的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要作用。本次實驗通過對AR患者外周靜脈血中Th9、Th22和Treg細(xì)胞的百分比,以及主要細(xì)胞因子與IgE的檢測與分析,探究AR患者Th9、Th22細(xì)胞和Treg細(xì)胞和細(xì)胞因子作用及其分泌異常的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

選取2019年4月至2019年10月入大連市中心醫(yī)院確診的過敏性鼻炎患者48例。過敏性鼻炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志2016年1月第51卷第1期《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2015,天津)》[2]。AR患者組共48例,其中男26例,女22例,年齡范圍(19-63)歲,平均年齡32.6歲(過敏性鼻炎患者樣本收集前1個月并未使用相關(guān)藥物進行治療)。對照組為40名體檢正常人,其中男21例,女19例,年齡范圍(20-57)歲,平均年齡35.9歲。健康對照組和AR患者組在性別、年齡方面均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要實驗儀器及試劑

1.2.1主要實驗儀器 流式細(xì)胞儀為Epics-xl型,來自美國貝克曼公司。酶標(biāo)儀為Sunrise酶標(biāo)儀,來自奧地利Tecan公司。特定蛋白分析儀為IMMAGE 800,采購自美國Beckman公司。此外,實驗還用到離心機、冰箱、37攝氏度的5%二氧化碳培養(yǎng)箱等。

1.3 標(biāo)本采集

采集過敏性鼻炎患者組和健康對照組的空腹靜脈血各3-4 ml留存于肝素抗凝管和促凝管中,標(biāo)本無溶血和乳糜。

1.4 標(biāo)本預(yù)處理

1.4.1收集外周血單個核細(xì)胞(PBMCs) 取無菌離心管一支,向其中加入2 ml的淋巴細(xì)胞分離液。然后取相同量的磷酸鹽緩沖液將靜脈抗凝全血1∶1稀釋,將稀釋后的全血慢慢地加入分離液離心管中,2000 r/min離心20 min,將單個核細(xì)胞用毛細(xì)吸管取出,放入另一支無菌離心管中待用。

1.4.2分離血清 待促凝采血管中的血液凝固,離心后取出血清并分為兩份：一份使用特定蛋白儀測定血清中總IgE的水平;另外一份置于-70℃冰箱冷凍保存,用于ELISA檢測細(xì)胞因子IL-9、IL-22和TGF-β的表達水平。

1.5 實驗方法

1.5.2Treg細(xì)胞的染色 取兩支試管分別加入實驗組和對照組抗凝全血各200 μl,每管加入20 μl APC標(biāo)記的抗人CD4和PC5標(biāo)記的抗人CD25單抗,混勻,于避光處孵育20 min。每管中加入2 ml溶血素溶解紅細(xì)胞,PBS緩沖液洗滌兩次后加入Foxp3 Fix/perm Buffer對細(xì)胞進行固定和破膜,洗滌細(xì)胞后加入PE標(biāo)記-抗人Foxp3單克隆抗體和同型對照10 μl,避光條件下孵育30 min,洗滌兩次后加入PBS緩沖液重懸細(xì)胞,上機檢測。

1.5.3流式細(xì)胞儀檢測Th9、Th22、Treg細(xì)胞 將染色后的Th9、Th22及Treg細(xì)胞放入Epics-xl型(Beckman coulter)流式細(xì)胞儀進行檢測。本實驗中,認(rèn)為CD4+IL-9+為Th9細(xì)胞,CD4+IL-22+為Th22細(xì)胞,CD4+CD25+Foxp3+為Treg細(xì)胞。

1.5.4測定IL-9、IL-22及TGF-β在血清中的表達水平 本實驗使用ELISA試劑盒測定血清中IL-9、IL-22及TGF-β的濃度,嚴(yán)格遵照說明書的指示進行操作。

1.5.5檢測血清中總IgE的含量 特定蛋白分析儀IMMAGE 800使用前已經(jīng)進行內(nèi)部沖洗、原裝配套試劑裝載和定標(biāo),將標(biāo)本預(yù)處理中分離所得血清放入儀器中進行檢測并獲得有關(guān)數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 Th9、Th22、Treg細(xì)胞的比例

同健康對照組相比,過敏性鼻炎患者外周血Th9細(xì)胞占PBMCs的比例明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001),Treg細(xì)胞所占比例明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001),而Th22細(xì)胞的比例與健康對照組相比無顯著性差異(P=0.64),見表1。

表1 兩組Th9、Th22和Treg細(xì)胞在PBMCs中所占比例

2.2 IL-9、IL-22、TGF-β及總IgE的表達水平

AR患者血清中 IL-9 和 IL-22細(xì)胞因子的水平相比對照組增高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001),AR患者血清中 TGF-β細(xì)胞因子的水平相比對照組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001),見表2。

表2 兩組TGF-β、IL-9和總IgE在血清中的含量

2.3 IL-9、TGF-β與總IgE的關(guān)系

IL-9與總IgE的含量在AR患者的外周血血清中呈正相關(guān)(r=0.488,P<0.05),TGF-β與總IgE的表達水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.679,P<0.05),見圖1和圖2。

圖1 AR患者血清中IL-9與總IgE含量呈正相關(guān)

圖2 AR患者血清中TGF-β與總IgE含量呈負(fù)相關(guān)

3 討論

過敏性鼻炎的發(fā)生與機體的過度免疫應(yīng)答息息相關(guān),疾病的發(fā)生由IgE介導(dǎo),伴有多種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子等成分參與其中[3]。在生活和工作中,如房間內(nèi)灰塵、花粉、柳絮之類的變應(yīng)原吸入機體后與人體IgE分子 Fab端結(jié)合,鼻黏膜處于致敏狀態(tài)[4]。當(dāng)機體再次遇到同一種物質(zhì)時,CD4+T淋巴細(xì)胞經(jīng)刺激后分泌的細(xì)胞介質(zhì)會與鼻粘膜血管、腺體和神經(jīng)末梢上的受體結(jié)合[5],從而引起鼻粘膜血管收縮、毛細(xì)血管通透性增加、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤組織[6],興奮副交感神經(jīng),進而引發(fā)打噴嚏、流鼻涕等臨床癥狀。本實驗中,與健康對照組相比,總IgE的表達水平在AR患者的血清中明顯升高,提示機體處于過敏狀態(tài)。除了免疫球蛋白參與到過敏性鼻炎中,T淋巴細(xì)胞的功能也不容小覷。在過去的一段時間中,很多研究人員認(rèn)為過敏性鼻炎的發(fā)生是與Th1、Th2兩者細(xì)胞的比例以及相關(guān)的一系列細(xì)胞因子有關(guān)系,在正常情況下,Th1、Th2類細(xì)胞二者的比例是屬于相對穩(wěn)定的情況,以保持體內(nèi)細(xì)胞免疫的正常工作;當(dāng)機體處于過敏狀態(tài)時,T輔助細(xì)胞向Th2方向偏移,從而引起Th2細(xì)胞亞群數(shù)量增多、功能增強,以及相關(guān)細(xì)胞因子優(yōu)勢表達,機體因此受到損傷[7]。然而,隨著研究的逐步深入,Th9、Th17、Th22、Treg細(xì)胞等T淋巴細(xì)胞亞群相繼被發(fā)現(xiàn),豐富了原先的理論,它們的作用也逐漸被重視起來。在本次實驗中,我們著重研究Th9、Th22、Treg在過敏性鼻炎中的意義。

2008年,通過PCR和胞內(nèi)染色的方法,研究人員Dardalhon和Veldhoen等于小鼠模型中發(fā)現(xiàn),IL-4和TGF-β都存在時,初始CD4+T淋巴細(xì)胞可分化成一種會分泌大量的IL-9的細(xì)胞,并將其命名為Th9細(xì)胞[8]。在Th9細(xì)胞的分化調(diào)控中,2010年Chang HC等人的研究中發(fā)現(xiàn),Th9細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分化的過程中,PU.1(ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一)被證明是其特征性因子[9],還有干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)也在Th9細(xì)胞誘導(dǎo)分化中起著重要作用[10]。此外,編碼細(xì)胞因子IL-9的基因Il9的轉(zhuǎn)錄量、T細(xì)胞受體活化、共刺激分子(如腫瘤壞死因子樣配體1A、OX40)、其他細(xì)胞因子(如白介素-4、白介素-2、TGF-β、白介素-25、白介素-33、IFN-γ)等也調(diào)控Th9的分化。對于過敏性疾病,Th9細(xì)胞的主要細(xì)胞因子IL-9起兩種作用,一是刺激上皮細(xì)胞表達嗜酸性粒細(xì)胞和T細(xì)胞趨化因子使免疫細(xì)胞聚集,激活T細(xì)胞和肥大細(xì)胞發(fā)揮作用;二是顯著刺激B細(xì)胞增殖分化和IgE的表達水平升高,二者可共同加重過敏炎癥。在Zhao Wei Gu等人的研究中發(fā)現(xiàn),過敏性鼻炎的小鼠模型中Th9細(xì)胞的比例高于對照組,IL-9的含量明顯高于對照組,而IL-9中和抗體的治療會減輕小鼠的過敏癥狀[11]。Ciprandi G等人發(fā)現(xiàn),隨著AR患者臨床癥狀愈發(fā)加重,血清中IL-9的表達量進而升高,反之亦然[12]。在本實驗中,AR患者Th9細(xì)胞的比例明顯升高;血清中IL-9水平也升高,并與血清總IgE呈正相關(guān),提示Th9細(xì)胞及其主要細(xì)胞因子的變化與過敏性鼻炎密切相關(guān),抗IL-9治療可為臨床AR治療提供一個新的靶點。

Th22 細(xì)胞是一種獨立于 Th1、Th2 和 Th17 細(xì)胞且主要分泌 IL-22 的新型 CD4+T 細(xì)胞,其配體依賴轉(zhuǎn)錄因子 AHR 可與炎癥介質(zhì)可通過影響 CD4+T 細(xì)胞進而調(diào)節(jié) IL-22 的表達。IL-22 有極其復(fù)雜的生物學(xué)作用,它既有抗炎活性,但在某些情況下也有放大炎癥反應(yīng)的作用[13]。支氣管哮喘和變應(yīng)性鼻炎均屬于過敏性疾病,目前支氣管哮喘的研究表明Th22 及其相關(guān)細(xì)胞因子分泌增高,但對于IL-22 在哮喘中對炎癥的促進或抑制作用還存在爭議。Th22 細(xì)胞及其細(xì)胞因子在變應(yīng)性鼻炎中的研究還未見報道,本研究發(fā)現(xiàn)在 AR 中 Th22 細(xì)胞比例與健康組相比無明顯變化,而 IL-22 細(xì)胞因子在變應(yīng)性鼻炎患者體內(nèi)表達增加,其原因可能是Th22細(xì)胞本身在機體內(nèi)數(shù)量極少,多數(shù)患者發(fā)病周期短且癥狀較輕,當(dāng)鼻粘膜發(fā)生過敏性病變產(chǎn)生局部性炎癥時,在全身血液循環(huán)作用下外周血中 Th22 可能會降低,導(dǎo)致 AR 患者Th22 與對照組相比無顯著差異。IL-22表達升高是因為IL-22 既可由 Th22 分泌,也可由 Th1、Th17、自然殺傷細(xì)胞(NK)、γδT 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等共同產(chǎn)生,因此 IL-22 在 AR 患者體內(nèi)的增加不足以證明 Th22 在變應(yīng)性鼻炎的免疫發(fā)病機制中發(fā)揮作用,因此還需進一步的研究證明。

1995年,坂口等人發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞可以抑制免疫反應(yīng)[14],它分泌的主要細(xì)胞因子是TGF-β和IL-10,表達特征性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3,進而調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞作用的強弱和關(guān)鍵功能。在人類個體中,機體的正免疫應(yīng)答被Treg細(xì)胞的細(xì)胞因子和細(xì)胞-細(xì)胞接觸反應(yīng)所影響,進而表現(xiàn)為免疫耐受[15]。近期的研究表明,Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例的多少隨著過敏性鼻炎的嚴(yán)重程度而變化[16],TGF-β能夠參與Foxp3的表達,維持Treg細(xì)胞的數(shù)量和其免疫抑制的功能。本次研究發(fā)現(xiàn),Treg 細(xì)胞比例及 TGF-β 細(xì)胞因子在變應(yīng)性鼻炎患者體內(nèi)表達減少,并且AR患者外周血血清中TGF-β的含量與IgE呈負(fù)相關(guān)。因此認(rèn)為Treg 細(xì)胞通過其分泌的細(xì)胞因子TGF-β發(fā)揮作用,Treg 細(xì)胞數(shù)量減少可能引起其抑制作用減弱,從而促進 AR 的發(fā)生。由此可以看出,AR的發(fā)生與維持機體免疫穩(wěn)態(tài)的Treg細(xì)胞在患者體內(nèi)失衡有關(guān)。

綜上所述,AR 患者外周血中 Th9、Treg 細(xì)胞及其相應(yīng)細(xì)胞因子分泌異常、比例失調(diào)在AR的發(fā)病過程中起著重要作用,其相關(guān)細(xì)胞因子 IL-9和 TGF-β 的檢測可為病情判斷提供重要參考指標(biāo),也可為臨床病因的分析指導(dǎo)和疾病的早期診斷提供理論依據(jù)?？笽L-9治療或許可為今后進一步研究AR患者抗過敏治療提供新的方向。Th22 細(xì)胞在 AR 中的作用則還需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)過敏性鼻炎患者外周血Th9細(xì)胞的百分比及細(xì)胞因子IL-9、IL-22和總IgE表達水平顯著升高,Treg細(xì)胞的百分比和TGF-β濃度顯著降低,并且IL-9與總IgE水平呈正相關(guān),TGF-β與總IgE水平呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)論說明患者外周血Th9、Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子的分泌異常、比例失調(diào)在過敏性鼻炎的發(fā)病過程中起著重要作用,可作為病情診斷的重要參考指標(biāo),也可為臨床病因的分析研究提供理論依據(jù),抗IL-9治療或許可為今后進一步研究AR患者抗過敏治療提供新的方向。而 Th22 細(xì)胞目前不明確,可能沒有參與 AR 的發(fā)病機制。