氧18示蹤法在浮游植物生產力監測中的應用?

曹凌志, 高詠卉

(上海交通大學海洋學院, 上海 200030)

中國東海是重要的碳匯區域,浮游植物對碳的吸收量為222(65.15～821 Tg·a-1),遠遠高于海氣間CO2的吸收量(7～23 Tg·a-1)和河流輸入量(17 Tg·a-1)[1]。長江口及其臨近海域是赤潮多發區,也是浮游植物的生產力高值區,對于調控東海海域的碳匯規模有重要影響[2]。

海區的凈群落生產力(NCP)能衡量營養狀態,當浮游植物的總生產力(GPP)大于群落呼吸(Community respiration, CR),即NCP>0,海區呈自養狀態,海洋對CO2吸收并形成碳匯;反之呈異養狀態,形成向大氣釋放CO2的碳源[3]。NCP與GPP的比值為周轉效率,反映浮游植物從總生產力向固碳量的轉化效率,它也是衡量浮游植物傳輸碳效率的重要指標。

18O示蹤法是目前同步測定浮游植物GPP和NCP中最直接有效的方法[4],具有靈敏、精確、無放射性等優點,但它難以像14C法一樣廣泛使用于海洋、水生環境中。這主要受限于樣品處理和分析中存在的技術困難。過去主要通過穩定同位素質譜儀(IRMS,Isotopic-ratio mass spectrometer)測定。雖然儀器精度高,但存在前處理繁瑣、培養水體量大、氣體從水中向氣態置換時易受到大氣污染、IRMS造價昂貴,需要配備特制18O16O (m/z=34)的法拉第杯等問題[5]。

四極桿質譜廣泛應用于殘余氣體分析(Residual gas analysis)。該方法將溶于水中的氣體和揮發性有機物分離,廣泛使用在氣體生成機理的研究、水污染檢測等領域[6]。結合同位素18O標記,國外陸續有基于四極桿質譜研究光合作用機制的報道。Ferrón等[4]首次利用18O示蹤法,結合選擇性薄膜分離和四極桿質譜,在寡營養鹽水體測定GPP和NCP,取得了與IRMS近似的計算結果(誤差低于±0.4‰)。該方法能避免IRMS前處理的繁瑣流程,降低誤差。

本文探索性地利用配備四級桿質譜的膜進樣質譜(Membrane inlet mass spectrometry, MIMS)測定同位素及氧氬比(O2/Ar),通過優化質譜的穩定性和標記物添加量,使得H218O示蹤法在近海更為實用。首次將該技術用于東海長江口海域,研究了春季藻華的種類和光合作用,建立GPP和NCP的光響應曲線,對比了浮游植物種類和生理生化過程在最大渾濁帶、鋒面地帶和舟山海域的區域性差異。

1 實驗方法

1.1 儀器設置

1.2 模擬實驗

1.2.2 示蹤劑用量 在模擬實驗Ⅰ結束三天后,進行模擬實驗Ⅱ。改變H218O濃度,以確保光合產物18O16O含量高于四極桿質譜的檢出限。即:在相同培養條件下,將不同體積的儲備液加入A.tamarense的培養瓶中,混勻。由于培養時間在0～8 h內該藻種的光合速率保持恒定(詳細結果見2.3),選取培養時長為3 h。3 h后加入飽和HgCl2溶液固定,中止光合與呼吸作用,研究H218O初始濃度對光合反應速率GPP和NCP的影響。

1.3 現場實驗

1.3.1 采樣站位 本次研究區域為受沖淡水、季風、沿岸流以及臺灣暖流等多重影響長江口鄰近海域 (122.0°E—123.5°E,29.0°N—32.0°N)[7]。在2020年5月,借助“浙漁科2號”科考船,在長江入海口附近選取了三個代表性站位:河口附近的最大渾濁帶(A,122.19°E,31.36°N)、北部咸淡水混合的鋒面地帶(B,122.35°E,31.61°N)和南部舟山群島附近(C,123.01°E,30.13°N)(見圖1)。用裝配溫度、鹽度、濁度、光強、葉綠素熒光等傳感器的Seabird-45 CTD和 8L采樣瓶采水。根據葉綠素熒光的垂向變化,將葉綠素熒光最大層的海水在不同光照條件下培養,測定生產力。固定浮游植物樣品,過濾并冷凍保存了葉綠素和營養鹽水樣。

圖1 航次大面站位(藍色小圓點)與代表性站位A(黑色圓點)、B(黑色三角形)和C(黑色方塊)示意圖

1.3.2 培養結果處理 取水樣350 mL,使浮游植物適應半小時后,加入17.5 mL H218O儲備液,使得δ18Owater達到約600‰。充分搖勻后,迅速分裝入18支培養管中并密封。實驗包括黑暗和4個光照梯度組,每組3個平行樣;在培養初始以HgCl2固定3支培養管,作為反應的初始值。培養實驗在甲板循環水水浴槽內進行,定時取樣固定。使用MIMS測量16O16O、18O16O和Ar信號,計算GPP和NCP。

1.4 數據處理

1.4.1 水采鑒定結果處理 藻種優勢度指數(Y=ni/N×fi),并取Y>0.02的藻種作為優勢種[10]。N表示所有藻種密度之和,ni表示第i種藻的密度,fi為該藻種的出現頻率。

1.4.2 生產力計算 水中18O16O的相對豐度(18R)、相對于參比樣品(Rreference)的δ18O(O2)(‰)和氧氬比過飽和度(Δ(O2/Ar)(%))分別由以下公式計算(式(1)～(3)[5]),其中樣品培養結束和零時刻分別用sample和t0標注。

(1)

(2)

(3)

由式4計算NCP(mmol ·m-3·h-1)[5]。

(4)

其中t1和t2分別代表培養的始末時間點,參比樣品的O2/Ar用reference標注。

根據式(5),計算GPP(mmol ·m-3·h-1)[5]。

(5)

培養實驗前后,溶解氧濃度([O2]: mmol· m-3)和同位素比例 (δ18O) 的變化分別用t1和t2標注。δ18Owater代表加入H218O后培養水樣中的H218O所占比例的增量,溶氧飽和濃度按水溫和鹽度計算[11]。此外,使用平衡水的18O16O、16O16O以及40Ar信號做誤差矯正。

利用NASA數據(https://oceancolor.gsfc.nasa.gov/l3/)得出現場培養的日均光強,并根據式6擬合GPP和NCP的光響應曲線[12]。

(6)

式中:P分別代表GPP和NCP(mmol ·m-3·h-1);E為光強 (μmol·m-2·s-1);Pmax、α和β為擬合系數。現場培養沒有出現明顯光抑制情形時,β等于0。

根據葉綠素熒光f與Chla實測值的線性關系(Chla=1.119 2f+ 0.206,R2=0.947 8),擬合Chla隨深度的變化。結合光響應曲線擬合系數,計算水柱積分GPP(mmol· m-2·h-1, 式(7))與水柱積分NCP(mmol·m-2·h-1, 式(8))。

(7)

(8)

1.4.4 數據匯總統計 對于模擬實驗Ⅱ算出的GPP和NCP,利用統計軟件SPSS 24做單因素方差分析(One-way ANOVA);將四極桿質譜得出的16O16O、18O16O和Ar信號以及δ18O(O2)、Δ (O2/Ar)、GPP、NCP等參數用繪圖軟件sigmaplot12.5呈現;使用Ocean Data View 5.1.7 制作鹽度、濁度和Chla平面圖。

2 結果

2.1 質譜性能測試

分離后的氣體總壓力保持在10-6mbar以下,在四極桿質譜的檢測量程內。通過掃描分析顯示, O2(m/z32)、18O16O (m/z34)和Ar (m/z40) 峰型對稱,無雜質峰干擾 (見圖2)。

圖2 氧氣(a)、重氧和氬氣 (b) 掃描示意圖

2.2 現場水文、化學參數特征

溫鹽垂向剖面(見圖3)顯示,最大渾濁帶表層溫度略高于21 ℃、鋒面地帶和舟山海域海表溫度都在20～21 ℃,該溫度已達到浮游植物生長條件。其中,鋒面地帶5～7 m出存在明顯溫鹽躍層;舟山海域溫鹽躍層在深度15 m處。

圖3 站位溫度、鹽度和葉綠素a的垂向剖面

表1 采樣水層的部分物理參數、葉綠素a (mg/m3)和各項營養鹽 (μmol/L)含量

在溫度、光照與營養鹽共同影響下,調查區表層葉綠素分布呈現近岸低,122.5°E—123.0°E處高的特征,變化范圍為0～10 mg/m3(見圖4(c)),鋒面地帶表層Chla明顯高于舟山海域和最大渾濁帶。Chla垂向剖面(見圖3)顯示,最大渾濁帶Chla普遍較低,不足1 mg/m3;鋒面地帶在溫鹽躍層以下,Chla逐漸上升,并在底層達到極高值,Chla平均含量高于5 mg/m3;舟山海域Chla在溫鹽躍層開始迅速下降,在30 m以深降至0.5 mg/m3以下。

圖4 長江口表層鹽度分布(a), 長江口表層濁度 (NTU)分布(b)及長江口表層葉綠素a (mg/m3)分布(c)

浮游植物種群結構呈現明顯空間變化。硅藻是最大渾濁帶和鋒面地帶的優勢種,甲藻成為舟山群島附近的優勢種。其中,最大渾濁帶的藻密度最低;咸淡水混合的鋒面地帶藻密度最高,絕大多數為骨條藻,種群結構較單一;舟山海域以東海原甲藻為主,并伴隨其它甲藻(見表2)。

表2 各區域采樣水層浮游植物優勢種

2.3 藻類培養模擬實驗

藻液中δ18O(O2)與Δ(O2/Ar)隨時間線性增長(見圖5)(δ18O(O2)=59.36t-18.93,R2=0.989 2;Δ(O2/Ar)=38.44t+ 9.509,R2=0.986 6)。光合速率穩定,GPP和NCP分別為(19.84±1.38)和(10.33±0.67) mmol·m-3·h-1。

圖5 δ18O (O2)與 Δ(O2/Ar) 隨培養時間的變化

添加微量H218O做標記(δ18Owater約221‰),MIMS也能靈敏地檢出 δ18O(O2)的增加(見圖6(a))。 MIMS測得δ18O(O2)與δ18Owater呈線性相關(δ18O(O2)=0.458 δ18Owater+ 2.306,R2=0.958 0)。而δ18Owater對Δ(O2/Ar)幾乎沒有影響(見圖6(b)) (Δ(O2/Ar)=0.006 414 δ18Owater+ 9.034,R2=0.749 2)。GPP、NCP分別為(23.24±1.89) 和(8.64±0.30) mmol· m-3·h-1,實驗濃度下18O的添加對GPP和NCP無顯著影響(One-way ANOVA,p>0.05)。

圖6 (a)δ18O (O2)與Δ (O2/Ar)隨δ18Owater的變化和(b) 各實驗組GPP與NCP

2.4 現場培養測定結果

在最大渾濁帶,隨培養光強增加,GPP略微增加(見圖7(a)),NCP并未隨光強的增大而增加(見圖7(b))。生物量高的鋒面地帶隨培養光強增加,GPP和NCP大幅度增加,強光下進入平臺期(見圖7)。在舟山海域,強光下GPP和NCP出現下降趨勢(見圖7)。

圖7 GPP(a) NCP(b)對光強變化的響應

垂向剖面顯示,在真光層淺且生物量低的最大渾濁帶,GPP和NCP在各深度均很小(見圖8(a))。在鋒面地帶,GPP與NCP的垂向分布高度一致,從深度約2 m處迅速遞減,到10 m以下穩定在較低水平(見圖8(b))。在舟山海域,GPP與NCP在混合層0～15 m隨深度變化均較小,深度15 m以下才開始降低(見圖8(c))。

((a) 最大渾濁帶The maximum turbidity zone;(b) 鋒面地帶The plume front; (c) 舟山海域 The waters of Zhoushan。)

在異養狀態的最大渾濁帶, 水柱積分GPP最小,水柱積分NCP為負;在水體深且透明度大的舟山海域,水柱積分GPP與NCP均遠高于鋒面地帶,周轉效率略低于鋒面地帶(見表3)。

表3 水柱積分GPP、NCP (mmol·m-2·d-1)及周轉效率

3 討論

本研究使用MIMS檢測18O16O、16O16O等信號,約4min達到平衡,精度可達0.3‰,國外相關報道的精度相近[5]。本研究的模擬實驗表明,培養時間與18O的添加均未對GPP和NCP造成顯著影響。在此基礎上設計的現場培養實驗中,培養站位的GPP和NCP均出現對光照的響應,且重現性良好(見圖7)。另一方面,根據碳和氧Redfield比值,得出長江口春季以碳為單位的水柱積分GPP。鑒于短時間14C培養得到的PP與GPP相近[13],將該GPP結果與往年東海海區PP范圍進行比較(見表4),其中往年PP的高值往往出現在鋒面或沿岸上升流區,在河口混濁區域出現低值,這些區域GPP與本研究采樣區域吻合。綜上所述,MIMS與18O培養法聯用可精確地研究長江口海域春季浮游植物的光合生產。

表4 歷年東海陸架地區積分生產力范圍[14-19]

本研究水柱積分GPP和NCP結果差異顯著(見表3),該差異源于長江口海域的物理環境。長江徑流沖淡水在5月往往由東南轉向東北[7],并在122.6°E附近與底部高鹽度的臺灣暖流相作用,形成表層鹽度梯度極大的羽狀鋒[20]。此處為咸淡水混合鋒面地帶,光限制減弱,是浮游植物光合生長的理想場所。而在長江口東南部的舟山群島附近海域,傳統觀點認為上升流和地形促進了浮游植物的高生產力,形成支持舟山漁場的環境條件[7],近年來的研究指出,盡管沖淡水主體在春末轉向北部,南部浙閩沿岸水域仍受一部分沖淡水影響,并形成底層鋒面,位于底層和表層鋒面之間的等深線30～50 m狹長區域,由于底部鋒面的層化能限制沿岸高濁度的水體混合,該區域的光照條件得以改善,是藻華的熱點地區[21]。

從種群結構上分析,不難推測鋒面水柱積分GPP和NCP主要由表層水體的硅藻貢獻,而舟山海域水柱積分GPP和NCP主要由0～15 m水體的甲藻貢獻。早先的研究將長江口海域分為淡水、沿岸低鹽、外海高鹽等不同浮游生物群落[7]。對2009年春季長江口海域浮游植物種群聚類分析顯示,長江口海域可分為以河口硅藻為主的混濁區帶,122.5°E以西的中肋骨條藻聚集區以及甲藻占比高的外海,孔凡洲等指出,在渾濁帶,藻類多樣性高,骨條藻、帕拉藻、圓篩藻等并存,但生物量極低;122.5°E以西混合區域多樣性最低,骨條藻密度高達3.2×106cells/L,占比高達94%;外海地區東海原甲藻密度可達52.7×104cells/L[22]。除了舟山海域站位的東海原甲藻測得密度偏低以外,本次浮游植物種群調查結果與2009年春季高度吻合(見表2)。綜上所述,在長江口物理環境的背景下,不同群落表現出不同的生理活性,從而形成了顯著的光合生產空間變化。

4 結語

本研究將18O示蹤、MIMS測定的快捷監測方法應用于長江口海域GPP和NCP的評估,發現鋒面地帶和舟山海域水柱積分GPP和NCP遠遠大于異養狀態的最大混濁帶,且周轉效率均很高;鋒面地帶和舟山海域不同的物理環境,使得兩區域的浮游植物種群結構不一,鋒面地帶的光合生產主要來自表層(0～5 m)的硅藻,而舟山海域0～15 m水層的甲藻貢獻高生產力。該方法對于研究海洋生態具有重要意義,值得進一步完善。

致謝：該航次(航次編號:NORC2020-03-01)由“浙漁科”2號科考船實施,在此一并致謝。