低劑量電離輻射聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療腫瘤的研究進展

孫超男，梁家齊，于昊彤，熱依萊，楊 珂，魏千皓，趙 剛

(吉林大學公共衛(wèi)生學院 國家衛(wèi)生健康委員會放射生物學重點實驗室，吉林 長春 130021)

1 靶向腫瘤的高劑量放療免疫調(diào)節(jié)作用有限

免疫檢查點抑制劑(ICB)如：細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)、程序性細胞死亡蛋白-1(PD-1)及其配體(PD-L1)抗體在臨床取得成功，引起腫瘤免疫治療研究的熱潮。然而，只有不到50%的癌癥患者適用于這種免疫療法，在適用于這種療法的患者中，也只有不到50%的患者真正從中受益[1]。腫瘤突變負荷低，腫瘤局部T細胞浸潤程度低，是導致ICB無法發(fā)揮作用的最常見因素[2-3]。因此，腫瘤免疫治療取得成功的關鍵是增加T淋巴細胞在腫瘤局部的浸潤。為了增強抗腫瘤免疫反應的療效，目前常規(guī)的做法是高劑量腫瘤局部單次外照射與免疫治療聯(lián)合應用。這樣做的理論依據(jù)是大劑量局部單次外照射起到腫瘤局部“原位疫苗接種”的效果，這種“原位疫苗接種”效應會進一步誘發(fā)“遠端效應”，“遠端效應”主要指局部放療觸發(fā)全身抗腫瘤作用，誘導遠處非靶向腫瘤消退[4]。但是，在實際臨床應用中，高劑量腫瘤局部單次外照射與免疫治療聯(lián)合應用誘發(fā)的這種遠端效應較為罕見[5]。這種單次腫瘤局部高劑量照射能夠改變非靶其他部位腫瘤微環(huán)境的想法未免不切實際，因為腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細胞和其周圍的宿主細胞相互作用共同決定的，是受到宿主周圍癌旁組織和正常組織的遺傳背景和分子狀態(tài)影響的[6-7]。雖然單次照射的“腫瘤疫苗原位接種”的概念可能沒有錯，但是臨床上眾多的腫瘤疫苗的失敗表明，要想消滅腫瘤，除了誘發(fā)機體的系統(tǒng)抗腫瘤免疫反應外，還必須改變腫瘤微環(huán)境(TME)[8]。而且單次大劑量照射的毒副作用和誘發(fā)的免疫抑制作用，都限制了其應用。研究表明，小劑量照射(這里指<3 Gy的劑量)可以激發(fā)機體的固有免疫和適應性免疫，從而有利于后續(xù)的免疫治療的進行[9-11]，本文對其進行簡要綜述。

2 低劑量放射性核素與ICB的聯(lián)合應用抗瘤效果明顯

Patel等[9]研究發(fā)現(xiàn)，應用放射性核素90Y-NM600與ICB聯(lián)合應用，在治療B78黑色素瘤小鼠模型中發(fā)揮了良好的抗瘤效果，即低劑量靶“向放射性核素治療聯(lián)合ICB可提高臨床前腫瘤模型的完全緩解率”。該研究中的NM600是一種治療性烷基磷酸膽堿類似物，優(yōu)先積累在幾乎所有的腫瘤類型中。NM600螯合放射性同位素釔90，即90Y-NM600半選擇性地將其傳遞到TME，用于腫瘤的治療或診斷。釔90發(fā)射的是β射線，在體內(nèi)的照射半徑是3.9 mm。釔90所發(fā)出的β射線幾乎全部被周圍的腫瘤組織所吸收，對臨近的骨髓、脾臟和周圍淋巴結(jié)的影響很小。臨床前動物實驗表明，90Y-NM600在生物學分布、腫瘤選擇性等方面都是安全的，適合人類應用，相關的更嚴格的臨床測試還在進行當中[10]。作者所測試的劑量范圍為0～5 Gy內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)，低劑量(<2.5 Gy)靶向放射性核素對腫瘤局部的照射，可明顯增加腫瘤局部髓性淋巴細胞CD11b+和NK細胞的浸潤，并上調(diào)了CD8+/CD4+CD25+FOXP3+的比值，從而增強了腫瘤細胞對隨后ICB治療的反應。

該研究顯示2.5 Gy的90Y-NM600發(fā)揮了良好的抗B78黑色素瘤的效果，這種局部低劑量內(nèi)照射使TME發(fā)生了免疫重編程，上調(diào)Ⅰ型干擾素(IFN)的表達，這種作用依賴于照射后激活的STING[cGMP-AMP (cGAMP) synthase (cGAS)/stimulator of interferon genes]通路，表現(xiàn)在敲除了STING通路的小鼠(Tmem173-/-)，治療作用也隨之消失。通過高緯度表型流式細胞術和轉(zhuǎn)錄組學分析也證明，低劑量內(nèi)照射使TME中的免疫細胞和內(nèi)皮細胞發(fā)生重編程。與釔90半衰期是2.5 d這個規(guī)律相吻合，這種變化的效果是短暫的，于引入釔90內(nèi)照射14 d后重返照射前的基準水平。在隨后的實驗中，90Y-NM600與ICB制劑CTLA-4單克隆抗體聯(lián)合應用，與90Y-NM600或CTLA-4單獨應用相比，流式細胞術和T細胞表面受體(TCR)測序都證明聯(lián)合應用顯著提高了CD8+T細胞的總量、TME中的記憶性T細胞和先天γδT細胞，同時，CD8+T表現(xiàn)出更強的克隆擴增性和更少的功能衰竭性。與單獨治療相比，聯(lián)合治療也顯著提高了荷瘤鼠的生存率和生存時間。進一步的研究證實，在90Y-NM600與ICB聯(lián)合應用的基礎上，再加入單次大劑量腫瘤局部外照射(12 Gy)，其抗瘤效果更佳，并容易誘發(fā)“遠端效應”，其抗瘤效果優(yōu)于任何一項或兩項單獨使用。此外，在聯(lián)合治療后獲得長期腫瘤清除的小鼠產(chǎn)生了保護性免疫記憶。因此推測，90Y-NM600的低劑量內(nèi)照射和單次大劑量外照射之間起到一個互補作用，從而進一步增強了腫瘤對ICB的反應，收到了良好的抗瘤效果。

總之，該研究顯示，低劑量靶向核素內(nèi)照射可使TME發(fā)生免疫重編程，并將“冷腫瘤”轉(zhuǎn)化為免疫反應性和ICB反應性腫瘤。這些發(fā)現(xiàn)為低劑量靶向核素內(nèi)照射聯(lián)合ICB治療“冷腫瘤”的臨床應用提供了理論基礎。

3 低劑量外照射與ICB聯(lián)合應用抗腫瘤效果明顯

有研究者把低劑量外照射與ICB聯(lián)合應用于ID8上皮卵巢癌小鼠模型的治療中[11]。通常，人類上皮卵巢癌對ICB治療是抗拒的，因為卵巢癌組織內(nèi)T細胞浸潤太少[12]。研究者用0.5～2 Gy劑量外照射小鼠整個腹部，結(jié)果顯示1 Gy照射的效果最佳，體現(xiàn)在“冷腫瘤”浸潤了更多的淋巴細胞、單核細胞、樹突細胞和NK細胞，并且CD8+/Treg 細胞比值也最高。這種低劑量腹部外照射，目的是使TME發(fā)生了免疫重編程，促進免疫細胞浸潤，而不是直接殺滅腫瘤細胞。這種低劑量照射的效果是短暫的，1 w后消失，T細胞浸潤恢復到照射前水平。然而，如果重復1 Gy/(次·w)，這種T細胞浸潤的效果就能夠持續(xù)。更重要的是，研究者發(fā)現(xiàn)，在1 Gy照射后第5天，免疫治療的靶基因開始上調(diào)，這些基因包括共抑制性T細胞受體PD-1和CTLA-4，Treg細胞表面的FOXP3，抗原遞呈細胞表面的CD40受體。這些發(fā)現(xiàn)提示，可以設計一種更全面的聯(lián)合治療方案，包括ICB使T細胞抗瘤作用更強，CD40配體刺激抗原遞呈細胞和低劑量環(huán)磷酰胺減弱Treg細胞。研究者展開了一個為期3 w的這種聯(lián)合治療方案，這種方案包括：1 Gy外照射，包括整個腹部；抗PD-1和CTLA-4的抗體；CD40受體激動劑和低劑量的環(huán)磷酰胺，作者稱之為RACIM(radio-combinatorial immunotherapy)。這種聯(lián)合治療的腫瘤反應率為83.5%，治愈率為15.0%，而其他方案對這種卵巢癌的治療是無效的。反褶積實驗(不含其中一種成分的RACIM)證實，“雞尾酒”中的所有成分都是生存獲益所必需的，去掉其中任何一種，都達不到理想的抗瘤效果。

RACIM治療可增加腫瘤局部浸潤淋巴細胞中的TCF1- PD-1+、CD4+和CD8+的效應T細胞數(shù)量，并高表達γ-IFN，顆粒酶B和穿孔素。RACIM也誘導出兩個新的樹突細胞亞群cDC2(conventional DCs type2)和MoDCs(monocyte-like DCs)，這兩個亞群都高表達NKG2D(NK group 2D)配體RAE1[13]。此外，在RACIM治療的腫瘤中，具有衰竭表型的CD4+和CD8+腫瘤局部浸潤T細胞上調(diào)了NKG2D共刺激因子受體。這些表現(xiàn)都是相互關聯(lián)的，因為這些表達NKG2D共刺激因子受體的腫瘤局部浸潤T細胞定義了一個具有高效應和增殖能力的典型的衰竭表型T細胞子集。實驗證實，如果用抗體封閉了NKG2D，RACIM的治療作用也就消失了。進一步實驗證實，如果用Fingolimod(FTY720)抑制了T淋巴細胞從周圍淋巴結(jié)的遷移，RACIM的作用也消失，表現(xiàn)在小鼠生存率下降，這個實驗證明，RACIM發(fā)揮作用依賴于T淋巴細胞從周圍淋巴結(jié)向腫瘤周圍的遷移和聚集。

4 低劑量外照射使處于免疫沙漠型腫瘤發(fā)生免疫重編程從而有利于ICB的抗腫瘤作用

研究者在動物實驗的基礎上進一步開展了臨床一期觀察(NCT0378179)[11]：研究者制定了嚴格的納入標準，共觀察了8例患者，包括轉(zhuǎn)移性卵巢癌、前列腺癌、膽囊癌和結(jié)腸癌，他們的腫瘤經(jīng)診斷都屬于免疫沙漠型腫瘤。具體的聯(lián)合給藥方案為：低劑量外照射整個腹部(0.5或1 Gy/次，共2 w，連續(xù)照射，中間停1 d，總劑量為6或13 Gy)，低劑量環(huán)磷酰胺，ipilimumab，nivolumab和阿司匹林，其中ipilimumab和nivolumab為ICB上市藥物，分別是針對PD-1和CTLA-4的中和抗體。研究者稱此方案的為RACIN(Radiation,Aspirin,Cyclophosphamide,Ipilimumab,Nivolumab)。經(jīng)過1個療程治療后，這8例患者中的3例，經(jīng)CT或PETS-CT診斷，照射野范圍內(nèi)腫瘤完全消除，4例照射野范圍內(nèi)腫瘤縮小，只有1例無反應，繼續(xù)長大。大于3級的免疫相關不良事件的發(fā)生率為25%，包括大腸炎、肝炎和心肌炎。與前期動物實驗相似，GeoMx空間轉(zhuǎn)錄譜分析證實，RACIN治療導致TME周圍CD4+、Th1、CD8+和效應性記憶T淋巴細胞聚集增多。與此相反，那1例治療效果不好的病例中，TME周圍的這些細胞聚集沒有變化，而抗炎型M2巨噬細胞卻增多。在治療效果良好的那7例患者中，低劑量照射野范圍內(nèi)的腫瘤都消退或者消失了，而照射野外的轉(zhuǎn)移瘤卻并未有反應。這個結(jié)果表明，低劑量照射增強ICB的效果不是依賴于“遠端效應”，而是低劑量照射對TME直接改變的結(jié)果。進一步推測，局部外照射改變了TME中的免疫環(huán)境，發(fā)生了免疫重編程，從而有利于后續(xù)的ICB治療清除腫瘤，盡管具體的細節(jié)還不清楚。這項研究最值得關注的點就是，TME的免疫重編程只局限于低劑量照射野范圍內(nèi)，而照射野范圍外并無此效應。

動物實驗和人體實驗的結(jié)果都表明，低劑量外照射可以安全應用于實體瘤，多發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤治療，使TME中的免疫細胞發(fā)生免疫重編程，使處于免疫沙漠型的“冷腫瘤”轉(zhuǎn)化為免疫反應型的“熱腫瘤”，從而有利于后續(xù)ICB的治療。

5 低劑量外照射可以改變腫瘤的免疫抑制微環(huán)境

研究表明[14]，用大劑量照射一處較大腫瘤(12 Gy/次，共3次)，結(jié)合低劑量照射多處較小的繼發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤(1 Gy/次，共2次)和ICB治療129Sv/Ev小鼠的344SQ-P肺癌。結(jié)果顯示，低劑量照射使TME周圍的巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化，并降低起免疫抑制作用的轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β含量，與單次大劑量照射和ICB結(jié)合，收到了良好的抗瘤效果。抗腫瘤作用依賴于固有免疫和獲得性免疫的綜合作用，特別是NK細胞、CD4+和CD8+的T淋巴細胞。研究者在動物實驗的基礎上，進行了臨床一期的觀察(NCT02710253)，入選共8例患者，是對常規(guī)的ICB治療抗拒，包括頭頸部鱗狀細胞癌、鼻咽癌、間變性甲狀腺癌、默克爾細胞癌、唾液腺癌、神經(jīng)母細胞瘤和黑色素瘤，聯(lián)合治療方案包括大劑量照射、低劑量照射和ICB治療。臨床結(jié)果顯示，這種聯(lián)合治療方案安全有效。入選的8例患者中有5例效果明顯。特別值得注意的是其中1例多轉(zhuǎn)移性口咽鱗狀細胞癌，經(jīng)聯(lián)合治療6個月后，腫瘤幾乎完全消失。另1例黑色瘤患者的腫瘤也是幾乎完全消失。這些令人鼓舞的臨床前和臨床數(shù)據(jù)表明，低劑量大面積照射轉(zhuǎn)移瘤，可增強后續(xù)局部大劑量照射對腫瘤的直接殺傷作用和“遠端效應”，增強ICB的治療作用，低劑量照射在腫瘤治療中可能發(fā)揮重要輔助作用，使那些對傳統(tǒng)ICB治療抗拒的腫瘤患者獲得新生。

6 總結(jié)與展望

以上臨床前和臨床試驗數(shù)據(jù)充分說明，低劑量照射在治療轉(zhuǎn)移瘤中的重要作用[9,11,14]。這種重要作用體現(xiàn)在低劑量照射促進T細胞向腫瘤局部浸潤，使免疫抑制型M2型巨噬細胞向抗腫瘤型M1轉(zhuǎn)化，使腫瘤局部脈管系統(tǒng)恢復正常，促進T細胞歸巢和活化，增殖，最終分化為效應性T細胞發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。

低劑量照射全部可見的轉(zhuǎn)移瘤病灶，可使“冷腫瘤”的固有免疫和適應性免疫反應都調(diào)動起來，并阻止了免疫抑制途徑，低劑量照射適合與ICB聯(lián)合應用。證明傳統(tǒng)的單次大劑量照射完全可以和低劑量照射相結(jié)合，發(fā)揮各自的互補作用，使單次大劑量照射的“遠端效應”發(fā)生的概率增加[9，11，14]。

低劑量靶向放射性核素治療與低劑量外照射相比，有顯著的優(yōu)勢，即低劑量靶向放射性核素可以沉積在一些影像學尚無法辨別的微小腫瘤組織內(nèi)發(fā)揮作用。因此未來的研究方向是開發(fā)更多種類、品質(zhì)更好的低劑量放射性核素，例如那些已經(jīng)在醫(yī)學領域應用的，如發(fā)射α射線的鐳223和發(fā)射β射線的镥177，是否可以靶向腫瘤局部和ICB聯(lián)合發(fā)揮抗腫瘤作用。另外，高劑量照射誘發(fā)的腫瘤本身的免疫抑制作用是否同樣會發(fā)生在低劑量照射與ICB聯(lián)合治療中，這些問題都是有待探討的關鍵點。未來的工作中，還需要明確針對不同腫瘤，小劑量的范圍以及照射的時間和順序，小劑量照射的最大耐受劑量或者最多耐受次數(shù)也需要探索，究竟哪種ICB藥物最適合與小劑量照射聯(lián)合應用，藥物的用量和用藥順序等等一系列的問題，均有待于深入研究和探索。