長距彗星蘭花蜜距石蠟切片的制備和顯微結構的觀察

崔以璨

(華中師范大學生命科學學院 湖北武漢 430079)

1 彗星蘭的主要特點

蘭科是僅次于菊科的單子葉植物中的第一大科，有2萬多個物種和悠久的栽培歷史，野生蘭科植物的分布范圍極為廣泛的，大多集中在熱帶和亞熱帶。彗星蘭(Angraecum)是蘭科彗星蘭亞族彗星蘭屬植物(圖略)[1]，這種植物原產于非洲大陸的馬達加斯加半島，是那里所特有的。本文研究的是彗星蘭其中的一個物種—長距彗星蘭(Angraecum sesquipedale Thouars)，常被稱為“達爾文蘭”，其最突出的特點即是其唇瓣特化，有長達近30 cm的花蜜距。

長距彗星蘭唇瓣向后延長呈管狀，形成細長的花蜜距(圖略)，長度可達30 cm。長距彗星蘭花蜜距里面有腺體等結構，花蜜則是由此類腺體分泌而形成，花蜜在花蜜距的底部。

2 實驗材料和研究方法

2.1 實驗材料

本試驗的試驗材料為長距慧星蘭，于2021年12月在上海辰山植物園溫室內取得后移栽回華中師范大學9號樓。待植物生長狀態穩定后采摘，在開放的新鮮花上取下花蜜距，將其浸泡在FAA固定液中保存后供實驗使用。

2.2 研究方法

石蠟切片法的具體步驟如下：

(1)固定與洗滌:在自然界中獲得的材料一般先放入FAA固定液中保存固定，直至需要使用時再取出。取出的材料要去除附著的固定液，以免影響后續的實驗。該洗滌步驟用流動的蒸餾水沖洗，并在蒸餾水中浸泡2 h左右直至固定液被完全洗去。

(2)脫水:固定后的組織內充滿水分，若不去除水分則后續的步驟如染色效果將不太理想。酒精即為最常見的脫水劑，按濃度梯度順序進行浸泡脫去材料中的水分。將材料放入梯度酒精中浸泡1 h-2 h，再兩次放入無水酒精中，每次脫水1 h-2 h。后續透明時二甲苯浸泡的材料塊周圍沒有出現水霧狀即為脫水完全，若透明過程中材料塊周圍出現水霧狀則需要重新退回無水酒精中脫水。

(3)透明:配制無水酒精和二甲苯1：1等比混合的試劑，將脫水后的材料放入并浸泡1 h-2 h，再放入二甲苯中1 h-2 h[2]。

(4)浸蠟:將材料與1:1等量混合的二甲苯和石蠟一起放入小坩堝中，蓋上蓋子于42 ℃的烘箱內放置24 h；后將蓋子打開，調溫度為60 ℃，恒溫24 h，此步驟的目的是讓二甲苯蒸發；24 h后傾去原溶液，將材料轉移至有熔融石蠟的小坩堝中，每隔1 h-3 h換一次純蠟，共換三次。

(5)包埋:將石蠟與材料倒入紙盒，用鑷子整理材料使材料切面向下，位置放正。將紙盒內石蠟倒滿后，靜置紙盒等待直至石蠟表面凝固出一層薄膜。將紙盒迅速放入冷水中使其凝固，然后反轉紙盒將其壓入水底，等待12 h后取出。

(6)切片與貼片:包埋好的蠟塊拆去紙盒修整成立方體，用膠水將其底部貼附于小木塊上，將處理好的小木塊放入冰室冷凍片刻使包埋材料與木塊間的粘性更強后取出。將木塊夾緊，調整到方便操作的合適位置，將切片厚度設置為8 μm，向著同一個方向勻速轉動切片機的搖桿，使切片連續不斷的切下。

用鑷子將切片夾到41 ℃水浴鍋中，待切片自然展開后，用涂有蛋白甘油的玻片抄起，撥正位置后放入45 ℃烘箱中烘干直至石蠟熔化。

(7)切片脫蠟:將烤干的切片放入二甲苯溶液中，充分浸泡2 min，再重復上述操作一次，以便脫去玻片上材料周圍的石蠟。

(8)復水:將切片依次放入梯度酒精和蒸餾水中各浸泡1 min-2 min。

(9)番紅染色:配置濃度為1%的番紅染液，將操作后的切片放入其中染色1 min-2 min。

(10)脫色:將切片放入梯度酒精中，每個濃度浸泡1 min。

(11)固綠染色:配置0.5%的固綠染液，將切片放入其中染色45s左右。后放入無水乙醇中脫色1min。此步驟結束后即可將玻片放在顯微鏡下觀察植物的組織結構。

(12)封片:切片置于60 ℃烤箱中烤干，在二甲苯中透明5 min后滴加1-2滴中性樹膠封片。

3 實驗結果分析

3.1 橫切面顯微圖

圖1所示即為長距彗星蘭花蜜距在光學顯微鏡4倍鏡下觀察到的整體橫切圖，長距彗星蘭的花蜜距是管狀結構，中間呈空心狀。

3.2 表皮細胞

彗星蘭是單子葉植物，內外兩側覆蓋表皮細胞，起到保護的作用，內外兩側的表皮分別為上表皮和下表皮，根據觀察可看出表皮細胞呈方形，外壁較厚，彼此互相嵌合，連接非常緊密，除了氣孔之外沒有任何間隙，如圖2所示。為適應光合作用氣體交換以及提高地上部水勢的需要, 植物表皮細胞進化出通道, 逐漸形成氣孔。根據觀察圖3圈出部位可以看到在花蜜距的內側表皮上有一對啞鈴型的細胞，那是單子葉植物表皮上的保衛細胞，一對保衛細胞中間出現橢圓形的裂口即為氣孔。氣孔的作用是調節和控制植物與外界環境之間的氣體交換以及水分的散失。可以看出此時內側表皮上的氣孔是處于關閉狀態的。

圖1 花蜜距橫切顯微結構圖

圖2 花蜜距表皮細胞

圖3 氣孔

3.3 維管組織

觀察圖4可以看到花距橫切顯微圖中有一圈染色較深的明顯部分，在基本組織中分散著的各種細胞緊密結合形成的束狀結構是植物的維管組織。因為彗星蘭是單子葉植物，與雙子葉植物無限閉合維管束不同的是單子葉彗星蘭的維管束是有限的，維管束相互連接構成維管系統。維管組織包括木質部和韌皮部，起到一定的支持功能，并對植物適應陸生環境起到一定的幫助。木質部細胞大并且排列較為蓬松，這部分質地堅硬，自下向上的主要輸導水分，同時與礦物質的運輸有關。韌皮部細胞小并且排列緊密，這部分質地較韌，自上而下的主要運輸有機養料，圖4為光學顯微鏡下維管束中木質部和韌皮部具體結構示意圖。

3.4 分泌組織

觀察圖5可以看到花蜜距內側表皮有呈棒狀的突起，疑似是表皮系統中起分泌作用的腺毛，腺毛是植物的一種外分泌結構。腺毛的種類繁多、形態各異，有防御作用、降毒作用，還可以合成、積累和儲存各種類型的天然產物。

圖4 維管組織

圖5 表皮內的腺毛

4 思考與討論

4.1 不足與反思

在切片過程中反復出現幾個問題：第一是偶爾切片會變成小卷堆疊在切片機的刀片上，不成帶。分析得知可能因為是室內的溫度過低。因為室溫及石蠟的熔點對切片的厚度有很大的影響[3]。切片較厚，高溫的影響較小，切片愈薄，對高溫愈敏感。第二是切片時蠟片不易連成蠟帶，組織塊易破碎,攤片時皺折多。根據實驗室條件猜測是因為常用于浸蠟與包埋的石蠟中含有空氣及雜質。有雜質和空氣進入的石蠟往往韌性較差,硬度不適當。可以在石蠟中加入一定量的蜂蠟,可提高蠟塊的硬度和韌度，切片時手感好, 易連片[4]。第三是切片向某一側彎曲而導致不能形成直帶，推測是因為蠟塊在此之前并未修整成規整的立方體或者是蠟塊與切片刀的刀面沒有保持平行。第四是切片上出現裂紋，反思實驗過程推測可能的原因是組織材料較硬或是在包埋的過程中石蠟冷凍太慢。實驗中使用的番紅染液的配制應選擇用蒸餾水取代酒精，這樣染色效果好，不易被褪色。洗去番紅和固綠浮色時，因酒精對番紅有分化作用，所以應避免時間過長，否則會導致染液顏色被褪色[4]。

本次實驗的目的是為了觀察到長距彗星蘭花蜜距的內部組織結構。因此在一個玻片上應該放有多個連續不斷的帶有組織材料的石蠟切片，以便后續在顯微鏡下觀察時可以看到花蜜距不同部位的結構特點，以此來比較材料不同部位組織細胞的相同和細微差別之處。比如花蜜距中應該有蜜腺的結構，但在染色后觀察玻片時并未發現相關組織，考慮可能是切片時漏去蜜腺等其他部位從而導致觀察的缺失。花蜜腺和腺毛一樣是植物體常見的外分泌結構，在長期的物種進化演變過程中分化而形成的一類腺體。蜜腺根據其著生位置可分為花蜜腺和花外蜜腺。大多數蘭科植物的香味十分濃郁或是蜜腺比較發達，這是因為它們要依靠特殊的氣味或是分泌的花蜜來吸引傳粉者。不同植物蜜腺的位置、形態、結構等都存在差異。

4.2 展望

本文通過石蠟切片實驗對長距彗星蘭的花蜜距內部組織結構進行了觀察并分析其具體功能，可以觀察到花蜜距的橫切結構中主要有起保護作用的表皮細胞，起輸導作用的維管組織，還有起填充作用的薄壁細胞等。前人對花蜜距的研究大多是基于生物個體水平上，對植物花部的特征進行描述和分類時有涉及到對花蜜距的描述，而對于花蜜距內部組織結構以及其相關生物功能的研究相對較少。

迄今為止，大多對花蜜腺的研究是對花蜜腺的發育解剖學研究和基于在電子顯微鏡下對超薄切片的觀察，而對于花外蜜腺尤其是對于花蜜距內蜜腺的研究十分稀少。因此，在今后應該更加深入的對花蜜距內蜜腺的結構進行細胞以及分子水平上的研究，并加強對花蜜距內蜜腺作用機理的應用。