天然產物:農藥新靶標與農藥創制間的橋梁

房正奇,高栓虎,何海兵

（華東師范大學 化學與分子工程學院 上海市綠色化學與化工過程綠色化重點實驗室,上海 200062）

0 引 言

聯合國糧農組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)數據顯示,全世界每年多達40%的農作物因蟲害而損失,經濟損失達700億美元.伴隨全球人口的持續增長,提高農作物產量、保證糧食安全始終是全球性的需求,發現及控制農作物病害是重要的保障措施之一[1].盡管轉基因作物、生物農藥等抵抗病蟲害手段相繼出現[2],但對于復雜地理和氣候環境下的病蟲害治理,化學農藥仍然是最重要的手段之一.

早在1746年,人們便從煙草中分離提取出尼古丁用于蟲害的防治,作為現代農藥起源的標志之一.化學農藥于20世紀40年代末開啟了高速發展,4,4′-二氯二苯三氯乙烷(dichloro-diphenyltrichloroethane,DDT)、有機磷農藥(organophosphorus pesticides,OPs)、蕓苔素內酯、N-甲基氨基甲酸酯類等有機農藥被合成或發現,該時代也被稱為“農藥發現的黃金時代”[3].然而,伴隨著傳統化學農藥的長期大量使用,農藥的抗性(resistance)、再增猖獗(resurgence)和殘留(residue)問題(“3R”問題)也日益凸顯.當下,對哺乳動物是否無毒或低毒,對空氣、土壤、環境生物等是否友好成為新農藥創制成敗的關鍵.無論“3R”問題的解決還是作物病蟲害防治的需要,新機制和新靶標的發現成為現代農藥創制的基本前提.

2012年美國國家環境保護局(environmental protection agency,EPA)將所有277種常規農藥的活性成分分為4類:生物類(biology,B),天然產物類(natural products,NP),合成類(synthesis,S)和合成天然產物衍生類(synthetic natural product derivatives,SND).考慮到NP、SND及B類農藥均源于天然產物,合計占比達69.3%,因此,基于天然產物的研究被視為新農藥創制和發展的最為重要的途徑之一.而天然產物及其衍生物作為工具化合物對新農藥靶點的探索和識別,則為后續農藥活性分子的設計、開發提供了分子基礎,是合成農藥(S)與合成天然衍生農藥(SND)發展的基石[4].

1 基于已知生物靶點發現的活性天然產物及農藥創制

1.1 以蟲體鈉離子通道為靶點的化學農藥發現和發展

生物體內的電壓門控鈉離子通道(voltage-gated sodium channel)是參與神經信號傳導的重要組成部分,以它為靶點的農藥能引起害蟲神經膜的去極化并促進神經遞質的釋放,使昆蟲行動失調、蟲體麻痹直至死亡.早期的DDT類農藥便是作用于該靶點的一種高效殺蟲農藥,但由于其對環境污染嚴重,對哺乳動物具有生殖毒性,因此被陸續禁止使用.

早在1828年,人們就已發現除蟲菊的提取物具有良好的殺蟲活性,該提取物后來被命名為“除蟲菊酯”(圖1).除蟲菊酯與DDT均作用于蟲體神經膜內的鈉離子通道,通過抑制鈉離子通道的關閉使蟲體麻痹直至死亡.天然的除蟲菊酯是一種理想的農藥,其具有廣譜的殺蟲活性,且對哺乳動物毒性較低,環境危害小,在體內易降解.但由于其具有光敏性,室外環境下易分解,導致持效性差,難以在大田推廣和使用.

圖1 天然除蟲菊酯及擬除蟲菊酯的化學結構Fig.1 Chemical structures of natural pyrethrin and some synthetic pyrethroids

研究發現天然除蟲菊酯的光不穩定性源于其酯的結構及三元環上的偕二甲基,為了改善其穩定性問題并提高殺蟲活性,科學家們嘗試對除蟲菊酯的結構進行改造,獲得了系列除蟲菊酯類似物—擬除蟲菊酯(圖1)[5].1973年,Elliot首次合成了藥效更強、對太陽光穩定的擬除蟲菊酯、二氯苯醚菊酯(permethrin)和氯氰菊酯(cypermethrin),與有機磷和氨基甲酯類農藥相比,僅需10%的劑量就能達到同等的殺蟲效果[6].日本Sumitomo化學公司的Ohno等[7]研究發現偕二甲基環丙烷結構的缺失對于殺蟲效果并無明顯影響,于1976年成功開發出了氰戊菊酯(fenvalerate又稱滅殺菊酯),其殺蟲活性優于二氯苯醚菊酯.在我國,華東師范大學的顧可權等[8-12]也開發了系列具有新結構的高活性擬除蟲菊酯類化合物,為我國擬除蟲菊酯類農藥的發展做出了卓越的貢獻.

1.2 以谷氨酸門控氯離子通道為靶點的化學農藥發現和發展

谷氨酸門控氯離子通道(glutamate-gated chloride channels,GluCls)僅發現于無脊椎動物,能夠調控神經傳導.大多數昆蟲具有單一的GluCls基因,因而該離子通道是一種理想的殺蟲農藥靶標.阿維菌素是首個作用于該靶標的高活性農藥,1976年由日本北里大學的大村智教授和Merk公司的Campbell教授從阿維菌素鏈霉菌中分離得到(圖2),后續通過氫化阿維菌素的22、23號位的雙鍵得到伊維菌素(ivermectin),該藥物有效治愈了長時間困擾非洲的寄生蟲疾病—河盲癥和象皮病.大村智教授和Campbell教授也因該成就,與我國科學家屠呦呦教授共同獲得了2015年諾貝爾生理學或醫學獎.伊維菌素對哺乳類動物的生物毒性極低,也作為抗寄生蟲獸藥被廣泛使用[13].

圖2 阿維菌素及阿維菌素衍生物的化學結構Fig.2 Chemical structures of avermectin and its derivatives

早期的研究認為,伊維菌素作用于昆蟲神經系統中的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)受體,促進神經遞質抑制劑GABA的釋放,抑制昆蟲神經傳導,使昆蟲麻痹死亡.后續Hibbs等通過伊維菌素和GluCl的復合物晶體(圖3,晶體數據來自PDB(protein data bank)數據庫,code:3RIA)證實伊維菌素是直接與GluCl結合,從而穩定了氯離子通道打開的構象,導致昆蟲死亡[14].Hibbs還將該復合物分別與GABA和木防己苦毒素(picrotoxin,一種氯離子通道開放抑制劑)進行競爭實驗,發現后兩者并不能競爭掉伊維菌素與GluCl的結合,間接證明伊維菌素與GluCl的結合方式不同于GABA及木防己苦毒素.

圖3 不同視圖下GluCl與伊維菌素的結合位點Fig.3 Two orientation of a GluCl interface binding with ivermectin

輝瑞公司通過改變發酵工藝中阿維菌素鏈霉菌培養基的成分,得到了道拉菌素(doramectin,圖2),與阿維菌素結構的差異在于25位的烷基鏈[15].該化合物對體內腸道線蟲,以及體外的皮蠅,毛虱等都具有良好的殺蟲活性,作為獸藥上市使用.

埃瑪菌素(emamectin,圖2)和埃伯利諾菌素(eprinomectin,圖2)是在阿維菌素的基礎骨架上將4″位的羥基轉變為甲氨基或乙酰胺基[16].前者的苯甲酸鹽對鱗翅目和雙翅目的殺蟲活性比阿維菌素提高了3個數量級,具有高效、低毒、低殘留等優勢,廣泛用于如蔬菜、棉花等作物的害蟲防治.后者作為一種常用的殺蟲獸藥,其具有廣譜、低殘留的特點,并且是為數不多可以用于家畜各生長時期的殺蟲劑,被廣泛使用.

1.3 以保幼素受體為靶點的化學農藥發現和發展

天然保幼素(juvenile hormone,圖4)又稱返幼激素、咽側體激素,是昆蟲發育過程中咽側體釋放分泌的一種激素,首次于1956年從天蛾蠶腹中提取得到.針對蟲卵,可以抑制胚胎的發育過程;對幼蟲可以增加其蛻皮次數,抑制其成蟲特征的出現;針對成蟲,能夠控制其性發育,產生不孕現象.天然保幼素類化合物具有獨特的殺蟲機制,選擇性高、殺蟲譜廣、污染小、對哺乳動物安全且不易產生抗性,是一種理想的殺蟲農藥[17].

圖4 以保幼素受體為靶點的化學農藥結構式Fig.4 Chemical structures of pesticides targeted on juvenile hormone receptor

20世紀70年代,基于天然昆蟲保幼素的結構,Zoecon公司的研究人員仿照保幼激素JH 的生物合成途徑,合成了系列保幼激素分子類似物,最終開發出第一個商業化人工合成昆蟲生長調節劑(insect growth regulator, IGR)—S-烯蟲酯(S-methoprene). S-烯蟲酯的活性是天然保幼素的近2 000倍,可以說S-烯蟲酯是源于自然而優于自然的典范之一.同時,Zoecon公司的研究人員基于昆蟲生物學提出了“生物合理”(biorational)的概念,以此描述烯蟲酯這類高效且特異性地滅殺害蟲,同時對人及其他非靶標生物又具有高安全性的殺蟲劑[18].

Suzuki等通過天然保幼素結合蛋白(juvenile hormone binding protein,JHBP)的gate-open構型以及與天然保幼素(juvenile hormone,JH)結合的單晶結構(圖5,晶體數據來自PDB數據庫,code:2RQF)解釋了其機制[19].在與JH結合后,JHBP較短的α1和α2片段與4條β蛋白片段形成包裹結構,其末端由α1的C段和α3的N端纏繞而成,而未和JH結合的JHBP則處于“開門”結構.后續的機理研究認為其存在一種“門閂機制”,在結合JH后JHBP的α1片段通過極性作用與β2片段結合,其中JH的不飽和酯進一步穩定了這樣的結構.

圖5 不同結合形式下JHBP的晶體結構對比Fig.5 Comparison of crystal structures of JHBP in different forms

因保幼素類化學農藥優異的殺蟲特異性及對哺乳動物的安全性,繼S-烯蟲酯后,以保幼素受體為靶點的化學農藥開發受到極大關注.雙氧威(fenoxycarb,圖4)又名苯醚威,1982年由R.Maag公司發現,作為針對白蟻的殺蟲劑批準上市.其雖具有氨基甲酸酯的結構,但對害蟲肌肉神經并無毒性,而對昆蟲具有高效、廣譜的類保幼激素活性,如對蟲卵具有滅殺作用,可抑制幼蟲的生長變態,造成幼蟲后期或蛹期死亡,同時對成蟲的翼肌組織具有分解作用,使其因性早熟喪失生育功能.日本Sumitomo化學公司也于20世紀80年代開始研究以天然保幼素受體為靶點的“生物合理”農藥,受到雙氧威的啟發,在保留二苯醚結構的基礎上成功開發出了蚊蠅醚(pyriproxyfen,圖4),其對同翅目、雙翅目、鱗翅目類害蟲均具有高效的殺蟲活性,且對魚類毒性低,是一種具有發展潛力的殺蟲劑[20].

1.4 其他基于已知靶標的活性天然產物發現及農藥創制研究示例

除上述幾個示例外,基于已知靶標由天然產物衍生而來的新農藥還有很多.比如通過改造自然蛻皮抑制劑得到的殺蟲劑蟲酰肼,其作用于蛻皮激素受體(ecdysone receptor),可誘使幼蟲蛻皮過多致死[21].魚藤酮(retenone,圖6)是早期人們從魚藤屬植物中分離得到的天然產物,對多數害蟲均有毒殺作用,尤其對蚜螨類害蟲活性較高.其作用靶點是昆蟲體內的線粒體,通過抑制昆蟲的呼吸作用,阻礙昆蟲體內ATP(adenosine triphosphate)的形成,最終導致害蟲得不到能量供應而行動遲緩、麻痹,直至死亡.后續發展的唑螨酯(fenpyroximate,圖6)也是一類以蟲體內線粒體為靶點的化學農藥,然而該類藥物易導致魚類中毒[22].多殺菌素(spinosad,圖6)是從多刺甘蔗多孢菌發酵液中提取得到的一種大環內酯類化合物,與同為大環內酯類農藥的阿維菌素類似,其對目標害蟲具有神經毒殺作用,是為數不多的雙靶點化學農藥.其可作用于神經內的煙酸乙酰膽堿受體,也可抑制γ-氨基丁酸受體使蟲體神經紊亂,麻痹死亡.或因其多靶點的特性,目前還未發現對多殺菌素有抗性的害蟲[23].

圖6 部分基于生物靶標發現的化學農藥Fig.6 Some pesticides discovered from biological targets

2 基于活性天然產物發現的新靶點及農藥創制

2.1 基于魚尼丁的靶標發現及農藥研究進展

印第安人將一種灌木“尼亞那”(ryania speciosa)的汁液涂到箭頭上用于捕獵,動物被射中后表現為抽搐直至死亡,后續的分離鑒定得到了一種名為“魚尼丁”(ryanodine,圖7)的化合物.藥理研究發現其能高親和性地與一種鈣離子配體門控通道結合,該通道因而也被命名為魚尼丁受體(ryanodine receptor,RyR)[24-25].魚尼丁受體分布在細胞質內質網的網膜上,在與魚尼丁作用后,該受體通道孔的有效直徑會發生改變,在中低劑量時(10 nmol/L～1μmol/L),對魚尼丁受體的離子傳導具有激活作用,在高劑量下(100μmol/L),則會產生阻斷作用.此外,魚尼丁與魚尼丁受體的結合作用還受到生物體內鈣離子濃度的影響,這是由于魚尼丁受體不同親和部位間具有復雜的協同效應導致.昆蟲的魚尼丁受體在氨基酸序列上具有很高的同源性,而與哺乳動物之間有很大的差異.因此,選擇性抑制魚尼丁受體活性,不僅機制特殊且對非靶標哺乳動物相對安全,是一個理想的農藥創制新策略.

圖7 以魚尼丁受體為靶標的農藥化學結構Fig.7 Chemical structures of pesticides targeted on ryanodine receptor

早在1920年人們就發現了魚尼丁的殺蟲活性,但其對哺乳動物和家畜都有較高的毒性,因而停止了使用.1989年日本大阪府立大學合成了一類吡嗪二酰胺類化合物,日本農藥公司以其為模板篩選得到了一種鄰苯二甲酰胺類化合物,發現這類化合物對鱗翅目類昆蟲具有較好的殺蟲活性.在此基礎上進行一系列的修飾與改造,獲得了上千個先導化合物,從中篩選得到了高活性殺蟲劑氟蟲酰胺(flubendiamide,圖7),其對多種鱗翅目害蟲的EC50在0.004～0.58 mg/L之間[26].機理研究發現,氟蟲酰胺的作用靶點為魚尼丁受體,但與魚尼丁的作用不同的是,其與魚尼丁受體的作用與鈣離子濃度大小無關.

以昆蟲魚尼丁受體為靶標的農藥的發展并沒有因此而停滯,2001年杜邦公司基于日本農藥公司氟蟲酰胺的研究數據及后續的研究,開發出鄰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑—氯蟲酰胺(rynaxpyr)和氰蟲酰胺(cyazypyr,圖7).與氟蟲酰胺相比,其更速效、殘效時間更長,具有更廣譜的殺蟲活性,且與其他殺蟲劑無交叉抗性.天津大學的尉遲之光團隊,結合氯蟲酰胺與魚尼丁受體復合物晶體的結構闡明了它們之間的相互作用模式(圖8,晶體數據來源于PDB數據庫,code:7CF9、6M2W),氯蟲酰胺與魚尼丁受體的結合后引起R4563片段發生了約60°的偏移,且其結合后會引起魚尼丁受體疏水端離子通道的直徑從10.5(1=10—10m)增加至17.1因昆蟲魚尼丁受體殺蟲劑表現出的優異性能,同類殺蟲劑的研究至今依然是殺蟲劑創制的熱點.

圖8 氯蟲酰胺與魚尼丁受體復合物的晶體結構Fig.8 Crystal structures of RyRs in complex with rynaxypyr

2.2 基于赤霉素的靶標發現及農藥研究進展

赤霉素(gibberellic acid,GA)是一種二萜類天然產物,廣泛存在于植物生長茂盛部分,如莖端、嫩葉、果實種子等.赤霉素參與到大部分植物的生長過程中,最早于1926年,黑澤英一教授發現感染了赤霉菌的水稻會出現瘋長的現象,至1938年住木諭介教授從赤霉菌的培養液中提取并鑒定了其活性化合物,命名為“赤霉酸”.迄今為止已有136種天然赤霉素被發現,以GA1至GA136命名,其中主要有4種赤霉素(GA1,GA3,GA4,GA7,圖9)具有促進植物的生長功能,作為生長激素類農藥使用.

圖9 部分赤霉素的化學結構Fig.9 Chemical structures of some gibberellic acids

關于作用靶點與機制,早期部分學者認為,赤霉素與很多類固醇激素具有相似的藥理,可以跨過植物的細胞膜直接作用于DNA或者RNA,影響轉錄和翻譯.另一部分學者認為,一定存在一種赤霉素的結合蛋白,從而影響植物的生長.而此后一系列能與赤霉素結合的蛋白被發現,逐漸證實了這個觀點,然而赤霉素的作用機制在當時仍未闡明.

現今,對于赤霉素的作用機制比較有說服力的論點則是GA-GID1-DELLA三聚體蛋白的形成(GA-binding protein,圖10,晶體數據來源PDB數據庫,code:2ZSH)[28].在細胞外GA濃度比較低時,GID1蛋白不予GA結合,此時DELLA蛋白會抑制GA應答基因的活性;而GA濃度較高時,GID1蛋白C端會與GA結合,形成疏水外圍二聚體GA-GID1與DELLA結合形成三聚體,以此促進DELLA蛋白的水解.赤霉素在植物生長過程中與各類激素的協同作用表現為:赤霉素與乙烯的作用能促進作物頂端彎曲生長,與生長素和脫落酸的協同作用能促進根的向地性和種子萌發,與蕓苔素內酯(一種常用的生長激素類農藥)能促進作物的細胞分裂及細胞生長,促進其生長,與細胞分裂素的作用能促進作物的花青素積累與下胚軸伸張[29].

圖10 GA3-GID1-DELLA復合物的晶體結構及其相互作用模型Fig.10 Crystal structure of the GA3-GID1-DELLA complex and a model of its interaction

2.3 基于章魚胺研究的殺蟲靶標的發現及相關殺蟲劑研究

章魚胺(octopamine,圖11)是從章魚的分泌物中提取得到的一種天然產物.后續證明在各類無脊柱動物體內都微量存在該胺類,并發現章魚胺在昆蟲體內扮演著類似腎上腺素的作用,負責昆蟲的內分泌、代謝、興奮等活動.其作用靶點也因而命名為“章魚胺受體”,一種G蛋白偶聯受體(G proteincoupled receptors,GPCRs).章魚胺通過與其作用完成神經傳導.該類受體在脊柱動物中尚未發現,因而,昆蟲體內的章魚胺受體近來也成為一種殺蟲農藥創制的重要靶標[30].

研究表明阿米曲士(amitraz,圖11)是一種潛在的作用于章魚胺受體的殺蟲殺螨的農藥.其能夠影響昆蟲的神經傳導系統,導致昆蟲過度興奮死亡,但是由于其對蜜蜂具有毒性被禁止使用.不過,基于章魚胺受體的農藥發展仍然在繼續[31].

圖11 針對章魚胺受體的天然產物及其衍生物Fig.11 Natural products and derivatives targeting on octopamine receptors

麥角生物堿(cycloclavine)是由麥角菌侵害小麥、大麥等禾本科作物而產生的生物堿,作用于章魚胺受體,具有一定的殺蟲活性,但與市面主流殺蟲劑相比,其活性不高.Netz等[32]對麥角生物堿的合成及衍生修飾開展了系統的研究工作:如對四氫吡咯環上N的?；?、吲哚苯環,以及吡咯環上鹵代、三氟甲基化等,獲得了系列結構新穎的麥角生物堿類似物(圖11).然而,遺憾的是這些新化合物的殺蟲活性均低于麥角生物堿本身,因此,基于麥角生物堿骨架,設計開發新的靶向章魚胺受體的殺蟲劑仍具有巨大的研究空間,同時也充滿挑戰.

3 總 結

天然產物因其來源多樣性、結構多樣性和功能多樣性,源源不斷地為農藥創制研究帶來新的機遇.天然產物不僅被用于已知農藥靶標的確證或作用機制的研究,還為基于已知靶標的功能分子篩選提供了豐富的化合物庫,從而得到新農藥創制所需的活性分子或骨架.天然產物的重要性還在于,以它們為工具化合物的研究可能帶來新農藥靶標的發現,從而為全新作用機制的農藥創制提供生物學基礎.隨著功能基因組學、蛋白組學和結構生物學的發展,天然產物仍將繼續在農藥靶標的發現或驗證到農藥創制之間發揮重要的橋梁和紐帶作用.