高脂血癥動物模型腎功能損傷機制及干預研究進展

周曉麗, 張 倩, 錢智勇

(天津市疾病預防控制中心毒理科,天津 300011)

高脂血癥（hyperlipidemia）嚴重危害人類健康，是由于長期血脂過高引發機體代謝紊亂，進而可引起心腦血管相關疾病。開發高效低毒的調節血脂藥物需要選擇適合的高脂血癥動物模型進行研究。建立成功的高脂血癥動物模型是開發安全有效的降脂藥物的關鍵環節。目前，高脂血癥動物模型主要有先天性、化學物質誘導和轉基因高脂血癥動物模型。先天性高脂血癥動物模型是在自然條件下發生的，可以很好地模擬人類疾病的發生、發展過程，應用價值高，缺點是來源比較少，不能大量應用［1］，常用于藥物的篩選及驗證。化學物質誘發的高脂血癥動物模型主要有兩種：一種是高脂飼料或高脂乳劑作用一段時間后形成的慢性高脂血癥動物模型，另一種是通過一次性注射化學物質形成的急性高脂血癥動物模型。目前，化學物質誘發的高脂血癥動物模型在研究高脂血癥時使用最多。轉基因高脂血癥動物模型是將外源重組基因轉染并整合到動物受體細胞基因組中，從而形成在體內表達外源基因的動物。轉基因動物模型是從細胞學角度驗證，適合研究細胞轉化、變異中某個致癌基因，缺點是只能用于特定實驗目的，而且技術難度較大，成本較高［2］。

早在1982 年，Moorhead 首次正式提出“脂代謝異常腎毒性”假說，指出高脂血癥對腎臟疾病的發生、發展具有重要影響［3］。相關研究發現，高脂血癥可以作為獨立危險因素參與腎臟疾病的發生發展，造成腎臟結構進行性改變，進而腎功能衰退［4］。高脂血癥在誘導腎功能損傷中起著重要作用，而腎功能損傷反過來也影響脂質代謝。高脂血癥對腎臟的損害是一個慢性積累過程，可能長期沒有出現臨床癥狀，即使已經發生了腎功能衰竭，從臨床表現也很難與原發性腎臟疾病伴高脂血癥相區別；因此相關的臨床試驗并不多，動物實驗研究卻相對較多［5］。張維忠等［6］通過對2009—2010 年成都鐵路職工健康體檢中有完整資料的2 578 例高脂血癥患者罹患慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的情況及相關危險因素進行分析，發現高脂血癥患者的白蛋白尿、血尿和腎功能下降發生率分別為14.08%、2.37%和3.26%，高膽固醇和三酰甘油水平均與尿微量白蛋白/肌酐比值呈正直線相關性；該人群中CKD的患病率為17.73%，CKD患病率較普通人群高，主要癥狀表現為白蛋白尿。另外，血脂異常等原因導致的心血管疾病嚴重影響CKD 患者的預后，已成為終末期腎臟疾病患者的首位死因［7］。因此，深入探討高脂血癥導致腎功能損傷的發生機制，尋找更為有效的能夠保護腎臟的脂代謝調節藥物，對于減少CKD的發生和改善CKD患者的預后具有十分重要的臨床意義。近年來高脂血癥引起腎功能損傷的因果關系還沒有得到廣泛的重視，脂質異常對腎功能損傷作用的相關機制研究還不夠深入和系統。本文旨在總結近年來利用高脂血癥動物模型進行腎功能損傷機制及干預治療方面的研究進展，為相關科研工作者提供一定的理論基礎。

1 運用動物模型研究高脂血癥與腎功能損傷的關系

高脂血癥不僅在心血管疾病的發生進展中起到重要作用，與慢性腎臟病同樣密切相關，并加劇腎臟疾病的發展［8］。研究證實，高脂飲食可引發高脂血癥，高脂血癥使得腎小球系膜增厚，小管間質明顯損傷，從而使腎小球硬化，病變損傷可累及整個腎臟［9］。動物實驗研究發現，原發脂代謝紊亂引起腎功能損傷的臨床表現主要為蛋白尿，病理表現主要為局灶性節段性腎小球硬化。通過對單腎高血脂組和雙腎高血脂組的尿微量白蛋白含量比較，發現單腎高血脂組的尿微量白蛋白水平更高，且有顯著性差異，推測單側腎臟受損的大鼠對尿微量白蛋白更敏感［10］。Liang等［11］用雄性金黃倉鼠通過腹腔注射鏈脲佐菌素建模，發現嚴重的高脂血癥可加速1 型糖尿病早期發展中的腎功能損傷。樊愛英等［12］研究發現，高脂血癥組大鼠的血清膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、尿蛋白和腎臟病理積分比腎臟疾病組高，腎臟免疫組織化學也顯示高脂飲食組細胞凋亡及死亡受體（death receptor，Fas）和死亡受體配體（death receptor ligand，Fas L）表達高于腎臟疾病組，由此可以判斷高脂血癥可加劇腎小球損傷和腎臟細胞凋亡，而且Fas 和Fas L 可能參與其發病過程。

2 運用高脂血癥動物模型研究腎功能損傷機制

脂質引起腎功能損傷的病理機制主要包括脂質誘導血管內皮增加、低密度脂蛋白沉積和氧化加速、單核巨噬細胞浸潤增加及活動病變區域內“泡沫細胞”的形成、系膜細胞增生及系膜基質增多以及腎小管間質的病變［13］。下面將從脂蛋白沉積、腎小球損傷和炎性反應3個方面分別展開介紹。

2.1 脂蛋白沉積作用

脂代謝紊亂是腎功能損傷的重要加重因素，尤其是低密度脂蛋白和氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）對腎臟的損害最大，研究也最多。Ox-LDL 通過增加血栓烷A2（thromboxane A2，TX-A2）和內皮素促進系膜細胞增殖和腎小球硬化。Ox-LDL還可通過刺激超氧陰離子的產生，誘導內皮細胞凋亡［14］。脂質運載蛋白（lipocalin）家族成員載脂蛋白M（apolipoprotein M，ApoM），相對分子質量大小約為2 000，常在腎臟中表達，通過調節β-高密度脂蛋白的形成和總膽固醇的反向轉運，影響脂質和脂蛋白代謝。在高脂血癥患者血清中也檢測到ApoM水平普遍升高［15］。此外，ApoM 通過與巨蛋白結合阻止了巨蛋白介導的胞吞作用，導致蛋白尿腎功能損傷。

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是存在于多種器官的分泌型糖蛋白，既能促進各種類型細胞粘附、趨化和信號轉導，又能在腎小球腎炎、腎小管間質性等相關疾病的腎功能損傷中發揮重要作用。Pei 等［16］評估OPN 對高膽固醇血癥引起的腎功能不全的影響，發現載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）敲除的小鼠經高膽固醇飲食后腎小球中出現較多的脂質沉積，然而在OPN 敲除的小鼠中血脂水平顯著降低，且腎小球中凝集素樣氧化的低密度脂蛋白受體-1 表達述評也降低。這些結果表明，OPN 可增加高膽固醇血癥引起的腎功能損傷，OPN 可能是高膽固醇血癥引起腎功能損傷的重要因子。

2.2 腎小球損傷

2.2.1 腎小球損傷與脂質沉積

近十年來研究表明，腎臟中的脂質積聚可導致腎功能損傷［17-18］。腎臟中脂質沉積可損傷腎皮質微血管，引起小動脈狹窄和球微循環、腎小球擴張以及腎間質腫脹，導致腎皮質缺血缺氧，最終通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統形成全身鈉潴留和微循環障礙［19］。脂質在腎臟中的沉積使得腎臟中膠原纖維和纖維連接蛋白的合成增加，導致腎小球硬化。過濾的血脂沉積在腎小球，引起腎小球膜細胞從靜止型轉變為增生型或者分泌型，并在此過程中獲得類似肌纖維的特征，腎小管上皮細胞也可能轉化為其他表型，可能導致腎纖維化，進而導致腎功能損傷。同樣有研究證實，通過高脂飲食飼養誘導的高脂血癥能夠導致腎組織內皮細胞和微血管功能紊亂，引起炎性浸潤的發生和腎纖維化進展［20］。

2.2.2 腎小球損傷與氧化應激

在嚙齒動物的相關實驗中發現，與高脂血癥相關的氧化應激增加可引起腎小球毛細血管內皮功能障礙，加劇脂質腎小球沉積相關的腎小球硬化發展［21］。Gwinner 等［22］在慢性腎小球腎炎和長期高脂血癥并存的大鼠模型中發現，黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）促進了氧自由基生成的增加，并加重了腎小管間質的損傷，表明XO在高脂血癥相關腎功能損傷的早期階段發揮了重要作用，其通過氧化還原反應上調單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1） 和 血 管 細 胞 黏 附 分 子-1 （vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）表達，介導巨噬細胞的浸潤。脂質以脂滴的形式存在于腎小球細胞或者基質中，發生氧化修飾，引起腎小管上皮細胞損害和基底膜通透性增加，從而發生蛋白尿。Sastre 等［23］發現，高脂血癥能夠誘導炎性反應并促進氧化應激；通過高脂喂養ApoE敲除小鼠后發現該小鼠的克老素基因（Klotho）表達下調，而且其機制可能是ox-LDL通過激活細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）和核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB），使得腎臟中Klotho 的表達下調，推測Klotho是血脂調節和腎臟疾病中的關鍵蛋白。

2.2.3 腎小球足細胞損傷

腎小球中的足細胞是一種修復再生能力有限的功能細胞。Nephrin蛋白是構成足細胞裂孔隔膜的主要結構蛋白，在控制腎小球濾過屏障通透性方面起關鍵性作用；足細胞損傷后，腎小球濾過屏障破壞并且無法修復，臨床表現主要為蛋白尿［24］。高脂血癥引起腎小球滲透性增加，表現為蛋白尿，其機制之一可能是因為足細胞足突骨架相關蛋白即LIM 結構域蛋白2（pdlim2）表達降低，導致足突融合，引起蛋白尿［5］。褚宇東等［25］通過細胞培養研究高脂血癥誘導的足細胞內質網應激及可能機制，發現高脂血癥可能通過誘導蛋白激酶R 樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和真核細胞起始因子2ɑ（eukaryotic initiation factor 2 ɑ，eIF2ɑ）的磷酸化，激活活化轉錄因子4（activated transcription factor 4，ATF4）轉錄，以及誘導CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋 白 （CAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP）高表達，引起足細胞內質網應激，而阿司匹林可能部分阻斷PERK 通路，進而對足細胞具有保護作用。

2.3 炎性反應

脂質代謝紊亂的另一個結局是大量炎性反應的發生，加劇了腎功能損傷［26］。研究發現，炎性細胞因子如腫瘤壞死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）和白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）可以影響腎小球濾過膜中總膽固醇介導的低密度脂蛋白受體的調節，提示炎性因子通過影響腎小球中脂質代謝而改變腎功能［27］。另有研究發現，高脂飲食喂養后慢性炎癥小鼠的腎臟脂肪變性嚴重，腎小球和腎小管損傷明顯，血小板糖蛋白Ⅳ（即CD36）表達增加，推測炎性應激通過激活CD36通路加重腎功能損傷，提示這種機制可能在患有慢性炎癥的肥胖個體中起作用，使它們更容易發生CKD［28］。在免疫復合物介導的腎炎期間，富三酰甘油脂蛋白（triglyceride rich lipoprotein，TGRL）狀態可能比低密度脂蛋白驅動的高膽固醇血癥對腎臟更有害，推測高TGRL 環境使腎臟在炎性損傷后腎功能損傷加重，同時巨噬細胞積聚增加，這可能對介導損傷起關鍵作用［29］。

Fang 等［30］發現，高脂血癥通過激活的Toll 樣受體4（toll like receptor 4，TLR-4）誘導非受體酪氨酸激酶（non receptor tyrosine kinase，c-Src）磷酸化，形成c-Src/表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）復合物，該復合物又激活蘇氨酸激酶（threonine kinase，AKT）和ERK，使得NF-kB通路激活，進而促進有關炎性反應和氧化應激的關鍵基因表達上調，造成腎功能損傷。此外，TLR4 主要通過c-Src/EGFR 復合物的磷酸化來調節EGFR 通路激活。這些結果證實，EGFR在肥胖相關性腎臟疾病發病機制中具有不利作用，為高脂血癥/血清游離脂肪酸（free fatty acids，FFA）誘導EGFR活化的機制提供了新的認識，并支持EGFR抑制劑應用于肥胖性腎臟疾病治療。

研究還發現，炎性因子抑瘤素-M（inflammatory factor tumor suppressor-M，OSM）在高脂飲食大鼠腎臟中的表達水平隨著高脂飲食時間延長而呈進行性增高；應用酶聯免疫吸附實驗法檢測高脂飲食大鼠血清中OSM 水平明顯增高，且變化趨勢與腎組織表達趨勢一致；進一步對OSM 表達與腎功能、血脂、24 h 尿蛋白水平進行相關性分析，結果顯示OSM表達與血清肌酐濃度（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、三酰甘油、總膽固醇及24 h尿蛋白均呈正相關，與高密度脂蛋白和低密度脂蛋白無明顯相關，提示OSM可能在脂質性腎功能損傷中發揮重要作用［31］。最近，有報告稱血管生成素樣蛋白3（angiopoietin like protein 3，ANGPTL3）基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，血脂水平明顯降低，提示ANGPTL3可能與高脂血癥腎功能損傷有關［32］。

3 運用高脂血癥動物模型研究腎功能損傷的干預治療

3.1 合成藥物的干預

他汀類藥物通過阻斷羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶（hydroxymethylglutaryl CoA reductase，HMG CoA-R）與底物結合位點，降低產物總膽固醇的生成，同時代償性促進低密度脂蛋白受體合成，加速低密度脂蛋白降解；而發揮降脂功能的機制主要是降低體內膽固醇水平，從而減輕高脂血癥所致直接腎功能損傷，其不依賴于降脂作用的腎臟保護作用近年來得到了一些學者的關注［33］。研究發現，在高脂飲食喂養的小鼠體內應用他汀類藥物的降脂作用較體外減弱，即體內出現“他汀類抵抗”；通過小鼠皮下注射酪蛋白使體內處于炎性反應狀態時造模成功，發現他汀類藥物的降脂作用較對照組減弱，同時腎功能損傷程度較對照組嚴重［34］。通過體外實驗研究發現，在腎小球系膜細胞培養基中加入IL-1β，能增加HMG-Co A的活性，抑制阿托伐他汀的降脂作用。他汀類藥物因其能有效降低膽固醇成為了目前臨床上應用最廣泛的降脂藥物。隨著他汀類藥物的廣泛應用，其安全性也受到越來越多的關注，有學者推測認為，他汀類降脂藥物不良反應的發生與藥物相互作用之間存在重要關聯［35］。

3.2 非合成藥物的干預

丹參是中國和韓國等亞洲國家最受歡迎的草藥之一。在亞洲傳統醫學中，丹參味苦、微寒，對心肝經絡能夠發揮治療作用。因此，丹參及其有效成分已被用于控制與心血管疾病相關的癥狀。Lim等［36］研究了丹參甲醇提取物（salvia miltiorrhiza methanol extract，SRme）對高脂血癥小鼠的作用及其分子靶點，即采用高脂飲食誘導小鼠高脂血癥，然后測定血膽固醇和三酰甘油水平，從而評價SRme 對高脂血癥小鼠的影響；結果發現SRme對高脂血癥小鼠增重無明顯影響，但血清中三酰甘油含量明顯降低，提示SRme可能通過抑制血清中三酰甘油水平升高，改善高脂飲食喂養小鼠的高脂血癥。另研究證明微小染色體維持蛋白（mini chromosome maintenance protein，Mcm）家族在DNA 復制中起關鍵作用，已被確定為改善高脂血癥的分子靶點。Fatma 等［37］研究丹參精油（salvia miltiorrhiza essential oil，SEO）和辛伐他汀對高脂血癥小鼠的影響，發現SEO 和辛伐他汀能抑制高脂飲食小鼠體質量增加，改善高脂血癥和肝腎功能紊亂，并降低活性氧生成；此外，與高脂飲食小鼠相比，總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白和膽固醇水平以及天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶、γ-谷氨酰轉肽酶和乳酸脫氫酶活性均明顯降低，而糞便脂質含量增加，而且SEO 的降脂效果優于辛伐他汀。這項研究結果強調了SEO 在治療高脂血癥方面效果顯著，而且不會產生不良反應，證明植物精油降低血脂和改善抗氧化狀態比合成藥物的效果更好。

核黃素又稱維生素B2，主要參與呼吸鏈能量產生，氨基酸和脂類氧化，嘌呤堿轉化為尿酸，芳香族化合物的羥化，蛋白質與某些激素的合成，鐵的轉運、儲存及動員，參與葉酸、吡多醛和尼克酸的代謝等，在人體正常生理功能中發揮著重要作用。Song 等［38］通過建立高脂大鼠模型，測定血清尿酸（serum uric acid，SUA）、SCr、BUN 水平，以及血清和肝臟黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）、腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）活性，鏡下觀察腎臟組織學改變；結果發現，與高脂血癥模型組相比，中、高劑量葉黃素組血清尿酸水平明顯降低，肝XOD和ADA活性明顯降低，血清BUN水平明顯降低，推測適當劑量的葉黃素可改善高脂飲食誘導的高尿酸血癥和腎功能不全。本課題組前期驗證了核黃素可能通過降低HMGR 的水平來調節肝脂水平，從而影響脂質代謝［39］。進一步研究發現，適量亞硒酸鈉與核黃素聯合暴露可以拮抗高脂飲食所致雄性大鼠血脂及血清肝生化指標的升高［40］。這些證據說明，核黃素在干預高脂血癥動物模型中具有一定的研究價值，其可能通過降低血脂水平，改善高脂血癥對腎功能的損傷。由此，本課題組進一步推測硒在高脂血癥中也具有一定的改善作用。周曉麗等［41］探討了富硒酵母對高脂血癥大鼠脂代謝的影響及調節機制，通過高脂血癥模型研究發現富硒酵母可以抑制高脂飼料引起的大鼠體質量增加，具有降血脂和抗動脈粥樣硬化作用，并對高脂血癥大鼠的肝臟組織具有明顯的修復功能，并且其機制主要是通過下調HMG-CoA-R mRNA 表達水平來調節脂代謝。Zhang等［42］在高脂血癥動物模型中發現，口服硒鎂聯合補充劑可抑制高脂飲食誘導的脂質、肝臟結構和肝功能指數增加，并增強抗氧化酶活性。因此，推測硒與鎂聯合是一種很有前途的治療策略，具有降低血脂和抗氧化作用，能夠保護肝臟免受高脂血癥的影響。

白藜蘆醇是多酚類化合物，主要來源于花生、葡萄（紅葡萄酒）、虎杖、桑椹等植物。白藜蘆醇是一種生物活性很強的天然多酚類物質，又稱芪三酚。有研究證明白藜蘆醇在高脂血癥腎功能損傷中發揮一定的干預作用。Takeshi 等［43］發現白藜蘆醇可顯著抑制腎炎引起的高脂血癥，其降低三酰甘油的作用比降低膽固醇的作用更為顯著。有研究者認為白藜蘆醇是一種有效的抗腎小球腎炎食物因子，能夠同時抑制蛋白尿、低蛋白血癥和高脂血癥。許伶等［44］建立了高脂血癥小鼠模型，不僅檢測血脂、體質量和腎功能，而且采用HE染色、過碘酸雪夫染色（schiff periodate staining，PAS）和免疫組織化學法檢測腎組織形態學變化，并進一步采用蛋白質印跡法和反轉錄-聚合酶鏈反應檢測小鼠腎組織中氧化應激和內質網應激相關蛋白的表達；結果發現白藜蘆醇能夠明顯降低高脂飲食小鼠的體質量、血脂和尿酸水平，改善腎小球系膜增生和腎小管纖維化，減少腎小球糖原沉積，下調纖維黏連蛋白（fibronectin，FN）的表達；而且白藜蘆醇能夠明顯上調抗氧化相關蛋白沉默信息調節因子2 相關酶1（silent information regulator factor 2 related enzyme 1，

SIRT1）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2） 和 谷 胱 甘 肽 過 氧 化 物 酶4 （glutathione peroxidase 4，GPx4）的表達，下調內質網應激分子標志葡萄糖調節蛋白78（glucose regulatory protein 78，GRP78）和CHOP mRNA表達。以上研究結果提示，白藜蘆醇通過抑制腎組織纖維化、氧化應激和內質網應激，可減輕高脂飲食導致的慢性腎功能損傷。

4 結語

綜上所述，大量高脂血癥動物模型研究腎功能損傷的實驗證實了高脂血癥可以影響腎功能損傷的發生發展，與機體脂質代謝密切相關。在脂質誘導腎功能損傷的分子機制方面，相關研究內容還不夠深入和系統，如腎功能損傷過程中信號轉導通路和相關基因表達等還需要進一步探討。盡管越來越多的高脂血癥干預靶點被學者們發現，但多數干預僅限于實驗階段，還沒有進行到臨床試驗，距臨床應用還有相當一段距離；而且靶點干預后對機體其他系統的作用和影響的相關研究還比較少。

高脂血癥動物模型實驗研究治療藥物的最終目標是為了能夠在患者身上體現良好的效果。盡管他汀類藥物仍然是干預高脂血癥的主要合成藥物，但隨著非合成藥物的研究日益廣泛和深入，越來越多的學者們注意到，未來非合成藥物有可能在干預高脂血癥的作用中發揮獨特的降脂效果，既能達到理想的降低血脂的目的，又能最大限度地降低對人體的不良影響，同時還能促進機體其他臟器的功能。因此，通過對高脂血癥動物模型引起腎功能損傷機制以及干預的進一步深入研究，可能為高脂血癥導致腎功能損傷在患者身上的研究和應用提供一定的理論基礎和實踐指導，同時也為未來高脂血癥動物試驗的研究提供理論支持。

[作者貢獻Author Contribution]

周曉麗提出文章寫作總體方向；錢智勇對文章進行總體的審閱和修改；張倩對文章中相關內容進行文獻的查閱和整理。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。