基于花期差異和ISSR-PCR分析的不同茶梅品種間親緣關(guān)系

高 園，解 元，楊自云，陳龍清，吳 田

（西南林業(yè)大學(xué) a. 云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心；b. 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650224）

茶梅Camellia sasanquaThunb屬于山茶科Theaceae山茶屬植物，是一種常綠的小喬木或灌木，與山茶花、滇山茶、金花茶共同組成山茶屬四大栽培觀賞類群，是具有較高觀賞價(jià)值的木本花卉[1]。茶梅原產(chǎn)于中國，在中國的栽培歷史長達(dá)1 200 a，自唐朝以來就有關(guān)于茶梅的記錄，史稱“海紅”。茶梅栽培容易，成型快，病蟲害少，既可觀花又可觀葉，故在園林綠化中有著廣闊的發(fā)展前景[2]。此外，茶梅花色艷麗，開花量多且花期長，其花能從當(dāng)年的10月下旬開至翌年的3—4月，是較為理想的冬季觀賞花卉之一。我國自20世紀(jì)80年代始，先后選育和引種了上百個(gè)茶梅栽培品種，但目前園林中栽培的品種仍以10多種傳統(tǒng)品種為主[3]，根據(jù)茶梅在園林中的不同用途，選擇適合應(yīng)用條件、品質(zhì)良好的茶梅品種顯得尤為重要，這就迫切要求育種工作者培育出更多能適應(yīng)園林需要的茶梅新品種，但是，僅僅依靠茶梅的形態(tài)學(xué)性狀往往很難明確種源間的關(guān)系及其來源。

隨著分子生物學(xué)的興起，國內(nèi)外的育種家及科研人員通常選用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)研究品種之間的親緣關(guān)系，采用形態(tài)學(xué)性狀并結(jié)合分子標(biāo)記等其他技術(shù)方法研究山茶科植物種質(zhì)資源親緣關(guān)系的也多有報(bào)道。張旻桓等[4]在研究山茶屬種質(zhì)資源親緣關(guān)系時(shí)提到，可將形態(tài)學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記兩者結(jié)合起來以揭示茶花品種間的親緣關(guān)系；成楊等[5]采用熒光SSR分子標(biāo)記與cpDNA序列分析技術(shù)相結(jié)合的方法，研究了江華苦茶4個(gè)自然居群32份資源的遺傳多樣性與親緣關(guān)系；周斌等[6]采用SSR熒光標(biāo)記引物，結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)，系統(tǒng)分析了雷波野生茶樹群體的遺傳多樣性及其與其他5個(gè)野生茶樹群體的親緣關(guān)系；楊培迪等[7]基于農(nóng)藝性狀和SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了25個(gè)江華苦茶品系的親緣關(guān)系；何秋梅等[8]基于表型性狀及化學(xué)成分分析研究了越南金花茶的親緣關(guān)系，從而為越南金花茶種質(zhì)分類和良種選育提供了重要依據(jù)。前人的研究結(jié)果表明，山茶科植物種質(zhì)資源親緣關(guān)系的研究頗具空間。目前，ISSR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于山茶屬和其他植物的品種鑒定[9-10]、指紋圖譜構(gòu)建[11-12]、種質(zhì)資源選育[13-15]、遺傳多樣性分析[16-18]及親緣關(guān)系研究[19-20]之中，而有關(guān)茶梅分子標(biāo)記方面的研究鮮見報(bào)道，也未見到運(yùn)用ISSR-PCR技術(shù)分析茶梅品種形態(tài)學(xué)性狀和花期差異來研究茶梅品種間親緣關(guān)系的報(bào)道。為此，以34個(gè)茶梅品種為研究對(duì)象，觀察并記錄其形態(tài)學(xué)性狀，尤其關(guān)注其花期，分析其花期差異，并利用ISSR-PCR技術(shù)分析其親緣關(guān)系，以期為茶梅種質(zhì)資源的品種鑒定、良種篩選和雜交育種等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的34份茶梅種質(zhì)均采自于中國科學(xué)院昆明植物研究所山茶園，其引種年份和原產(chǎn)地等信息詳見表1。采集完整、健壯、表現(xiàn)良好的新鮮葉片，將其放入自封袋中置于冰盒內(nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，暫存于-80 ℃的冰箱中以備提取其DNA之用。

1.2 DNA的提取及質(zhì)量檢測

按照天根新型植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書中說明的操作步驟，合理使用試劑盒中的試劑及材料，對(duì)所采集的茶梅材料進(jìn)行DNA的提取。制作1.0%的瓊脂糖凝膠，并對(duì)提取茶梅葉片的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察其完整性，并利用紫外分光光度計(jì)測定DNA的質(zhì)量濃度，以保證DNA質(zhì)量能滿足后續(xù)ISSR-PCR擴(kuò)增的要求。參照吳田等[21]的方法將DNA稀釋至2 μg/μL后備用。

1.3 ISSR引物來源及其退火溫度的篩選

選用的ISSR引物為哥倫比亞大學(xué)設(shè)計(jì)公布的100個(gè)通用引物，隨機(jī)選擇其中的28個(gè)ISSR引物序列（814、815、818、822、823、824、825、826、827、834、835、836、840、841、842、844、845、846、847、848、850、853、854、855、856、857、858、866）以用于PCR擴(kuò)增。所用ISSR工作引物均由上海生工有限公司合成，引物濃度均為10 μmol/L。選取‘立寒1號(hào)’茶梅樣品的DNA模板，采取引物篩選與退火溫度優(yōu)化相結(jié)合的方法，先對(duì)這些引物分別使用52和56 ℃的退火溫度（參照吳田等[21]的方法篩選并作了相應(yīng)的優(yōu)化及調(diào)整）進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，然后對(duì)電泳檢測后有條帶的引物進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，再選擇擴(kuò)增條帶較多、穩(wěn)定、清晰的工作引物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 34個(gè)茶梅品種的引種年份和原產(chǎn)地Table 1 Year of introduction and geographical origin of 34 C. sasanque cultivars

1.4 ISSR-PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測

ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、反應(yīng)程序、電泳檢測等均參照吳田等[21]的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)或操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)凝膠電泳結(jié)果，統(tǒng)計(jì)各ISSR引物對(duì)34個(gè)茶梅品種的擴(kuò)增情況，采用Excel 2010軟件記錄條帶數(shù)量（記錄到的條帶共有142條），將同一水平位置有條帶的記為1，無條帶的記為0，建立二元數(shù)據(jù)矩陣。利用NTsys 2.10e軟件，采用非加權(quán)平均法，對(duì)34個(gè)茶梅品種進(jìn)行聚類分析，繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶梅品種的形態(tài)學(xué)性狀及花期

對(duì)34個(gè)茶梅品種的樹形、葉質(zhì)、花色、花瓣類型、花瓣數(shù)量、花期等6個(gè)形態(tài)學(xué)性狀的觀測結(jié)果見表2。其中，早花品種有10個(gè)，分別是‘茶梅原種1號(hào)’‘茶梅原種2號(hào)’‘葡萄酒’‘初光1號(hào)’‘初光2號(hào)’‘棉花糖’‘酒中花’朝中鶴’‘虹’‘天女舞’；晚花品種有6個(gè)，分別是‘東牡丹’‘丹玉1號(hào)’‘丹玉2號(hào)’‘丹玉3號(hào)’‘久富’‘笑顏’。茶梅品種的花色與花瓣種類繁多，34個(gè)茶梅品種的花色共有14種，花瓣類型有6種。其中，玫瑰紅色茶梅品種的花瓣類型多呈半重瓣型，如‘立寒1號(hào)’‘立寒2號(hào)’‘小玫瑰1號(hào)’‘小玫瑰2號(hào)’；深紅色與深粉紅色茶梅品種的花瓣類型都為牡丹型，如‘東牡丹’‘丹玉’‘昭和之榮’‘花昭和之榮’；在白色系茶梅品種中，除‘富士之峰’的花瓣類型為玫瑰重瓣型外，其他白色系品種的花瓣類型大多為單瓣型；外瓣先端淺紅而內(nèi)瓣白色茶梅品種的花瓣類型為玫瑰重瓣至完全重瓣型，如‘初光1號(hào)’‘初光2號(hào)’；粉紅色茶梅品種的花瓣類型多種多樣，‘厚禮’和‘粉柱子’的花瓣類型都為牡丹型，‘棉花糖’為玫瑰重瓣型，‘天女舞’為單瓣型，‘粉雪’為牡丹型至玫瑰重瓣型，‘笑顏’則為半重瓣型。

表2 不同茶梅品種形態(tài)學(xué)性狀的觀測結(jié)果Table 2 Morphological characters of different C. sasanque cultivars

2.2 茶梅ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果及遺傳多樣性分析

從隨機(jī)選取的28個(gè)ISSR工作引物中優(yōu)選出10個(gè)條帶清晰穩(wěn)定、明亮度良好、多態(tài)性豐富的ISSR擴(kuò)增引物，引物的基本信息見表3。34個(gè)不同品種的茶梅材料共擴(kuò)增出142條重復(fù)性好、清晰穩(wěn)定的PCR條帶，平均每個(gè)引物能擴(kuò)增出13～14條條帶，其中多態(tài)位點(diǎn)數(shù)136個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）為95.77%。在所檢測的引物中，引物841擴(kuò)增的條帶最多、圖像清晰、多態(tài)性高（圖1），能有效區(qū)分茶梅品種，這表明采用ISSR技術(shù)對(duì)區(qū)分茶梅的親緣關(guān)系有較好的效果。各引物擴(kuò)增結(jié)果的PPB為81.82%～100%，說明這些茶梅品種的遺傳多樣性較豐富，遺傳基礎(chǔ)較寬。

表3 優(yōu)選出的10個(gè)ISSR擴(kuò)增引物的基本信息Table 3 Basic information of 10 primers selected for ISSR amplification

圖1 引物841的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 Result of amplification by primer 841

2.3 聚類分析

基于ISSR擴(kuò)增結(jié)果，使用NTsys 2.10e軟件，對(duì)34個(gè)茶梅品種材料擴(kuò)增出的142條多態(tài)性條帶進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果獲得的34個(gè)茶梅品種的遺傳相似性聚類圖如圖2所示。圖2顯示，其遺傳相似性系數(shù)為0.62～0.91。當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.70時(shí)，34個(gè)茶梅品種被聚成6大類群。由此可見，34個(gè)茶梅品種的聚類差異明顯，說明其遺傳多樣性豐富，且在形態(tài)學(xué)性狀方面存在明顯差異。

由圖2可知，類群Ⅰ和Ⅵ之間分子生物學(xué)性狀差異明顯，類群Ⅰ與Ⅵ各僅有1個(gè)茶梅品種，分別是‘立寒1號(hào)’和‘笑顏’，‘立寒1號(hào)’的花期為11月—翌年2月，‘笑顏’的花期為12月—翌年4月，即‘立寒1號(hào)’的花期短于‘笑顏’的，但其始花期要早于‘笑顏’的。

類群Ⅱ包含‘乙女’‘立寒2號(hào)’‘富士之峰’‘昭和之榮1號(hào)’‘花昭和之榮’‘茶梅原種1號(hào)’‘久富’‘小玫瑰1號(hào)’‘茶梅原種2號(hào)’‘昭和之榮2號(hào)’‘白樂天’‘銀月’這12個(gè)茶梅品種。其中，‘小玫瑰1號(hào)’‘白樂天’和‘銀月’這3個(gè)茶梅品種均產(chǎn)自浙江，其他9個(gè)茶梅品種均產(chǎn)于日本。當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.79時(shí)，‘白樂天’和‘銀月’聚為一類，其植物學(xué)性狀和分子生物學(xué)性狀表現(xiàn)均一致。但是，當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.78時(shí)，‘乙女’‘立寒2號(hào)’‘富士之峰’與‘昭和之榮’的花期相同，其花均在11月—翌年2月盛開，雖然其在花瓣類型及花色等其他形態(tài)學(xué)性狀的表現(xiàn)有所不同，但在聚類圖中均被歸為一類，這說明所檢測擴(kuò)增部分中極有可能存在控制著這些性狀的相關(guān)基因，也反映出部分品種之間其植物學(xué)性狀表現(xiàn)和分子生物學(xué)性狀表現(xiàn)均存在差異。

圖2 不同茶梅品種的聚類圖Fig. 2 Dendrogram of different C. sasanque cultivars

類群Ⅲ包含‘東牡丹’‘丹玉1號(hào)’‘丹玉2號(hào)’‘丹玉3號(hào)’這4個(gè)茶梅品種。從圖2中可以看出，在類群Ⅲ中，‘東牡丹’與‘丹玉’可以歸為一類。從植物學(xué)性狀上看，兩者的形態(tài)學(xué)性狀幾乎完全相同，其花期均為11月—翌年4月，其花色均呈深紅色，其花瓣類型均為牡丹型，且其花瓣數(shù)量都在30枚以上；而不同的只是‘丹玉’的花瓣和葉片上均出現(xiàn)了變異的白斑。這一結(jié)果說明，兩者的遺傳差異較小，其親緣關(guān)系較近，表明了其在植物學(xué)性狀和分子生物學(xué)性狀上的一致性。同時(shí)，此3個(gè)‘丹玉’品種雖然因其原產(chǎn)地和引種時(shí)間大致相同而聚在一起，但不完全重合，這說明其個(gè)體間存在遺傳差異性。

類群Ⅳ包含‘圣誕節(jié)’‘詹妮弗·蘇珊’‘葡萄酒’‘初光1號(hào)’‘厚禮’‘棉花糖’‘龍光’‘粉柱子’‘酒中花’‘初光2號(hào)’‘天女舞’‘小玫瑰2號(hào)’這12個(gè)茶梅品種。這12個(gè)茶梅品種因其產(chǎn)地和引種時(shí)間大致相同，其中的大多數(shù)茶梅品種的始花期也都集中在10—11月，故而聚為一類。這說明其親緣關(guān)系較近，其遺傳差異較小，但不排除存在局部差異的可能性。當(dāng)遺傳系數(shù)接近0.76時(shí)，除‘圣誕節(jié)’的花瓣數(shù)量有5～7枚之外，‘詹妮弗·蘇珊’‘葡萄酒’‘初光1號(hào)’‘厚禮’‘棉花糖’的花瓣數(shù)量均在30枚以上；當(dāng)遺傳系數(shù)接近0.80時(shí)，‘初光1號(hào)’‘厚禮’‘棉花糖’并未聚為一類，而‘厚禮’和‘棉花糖’卻被聚為一類，因?yàn)椤豕?號(hào)’與‘棉花糖’的花期相同，都為10月—翌年1月，且兩者的花期都早于‘厚禮’，因此‘初光1號(hào)’‘厚禮’‘棉花糖’終被聚為一類。

類群Ⅴ包含‘朝中鶴’‘緋音紅’‘粉雪’‘虹’這4個(gè)茶梅品種，這4個(gè)茶梅品種的形態(tài)學(xué)性狀整體吻合，但存在局部差異。當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.70時(shí)，4個(gè)茶梅品種歸為一類；但當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.76時(shí)，茶梅品種‘虹’與其他3個(gè)茶梅品種之間呈現(xiàn)出明顯的分支差異。觀其形態(tài)學(xué)性狀可知，其主要差異在于葉片質(zhì)地，‘虹’的葉片質(zhì)地薄，不夠光澤，而其他3個(gè)品種的葉片質(zhì)地均厚，均富有光澤；除此之外，‘虹’與‘朝中鶴’在其他形態(tài)學(xué)性狀方面大致相同，如花瓣類型都為單瓣型，其花期都為10—12月，其花色均以白色為主，而以紅色為輔。當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.78時(shí)，‘粉雪’與‘緋音紅’的花期相同，均為11月—翌年2月，但兩者在花色上存在差異，‘粉雪’為粉紅色，‘緋音紅’初開時(shí)呈紅色，花開后呈紫紅色。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

本研究分析了34個(gè)有特色或引種至昆明較為成功的茶梅品種間的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，其ISSR條帶表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，PPB為95.77%，遺傳相似性系數(shù)為0.62～0.91，變幅為0.29。這一研究結(jié)果與胡仲義等[22]采用ISSR標(biāo)記技術(shù)分析得出的26個(gè)川茶花品種遺傳相似性系數(shù)為0.615～0.913、變幅為0.298的結(jié)果相似，這表明供試的茶梅品種之間其遺傳差異較大，遺傳基礎(chǔ)較寬。類群間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、遺傳差異較大的原因可能有如下兩個(gè)方面的：一方面，這些茶梅大多是從外地引種于此的，引種地與原始環(huán)境的差異造就了其基因的差異。另一方面，引種時(shí)間不一，加之園內(nèi)又陸續(xù)引進(jìn)新品種，這就增加了茶梅的新遺傳基因，且所選材料都是取自引種時(shí)間在10 a以上的植株，其已適應(yīng)了引種地的環(huán)境，這一環(huán)境對(duì)其基因型也可能產(chǎn)生了一定的影響；同時(shí)，茶梅還極有可能發(fā)生了芽變[23]，這為茶梅的生長和變異創(chuàng)造了條件。雖然部分品種的植物學(xué)性狀表現(xiàn)和分子生物學(xué)性狀表現(xiàn)之間存在差異性，但是，ISSR-PCR的分析結(jié)果與茶梅品種的形態(tài)學(xué)觀測結(jié)果基本吻合。聚類分析結(jié)果表明，供試的34個(gè)茶梅品種被聚成6大類群，這6大類群之間可以相互作為親本材料進(jìn)行雜交，其中類群Ⅰ和Ⅵ不管在形態(tài)學(xué)性狀還是分子生物學(xué)性狀上都表現(xiàn)出遺傳差異最大的特點(diǎn)，‘立寒1號(hào)’和‘笑顏’尤可選為親本材料，將能獲得較多的分離，以培育茶梅新品種。

3.2 討 論

選育新品種是改變國內(nèi)茶梅育種工作落后局面的前提。隨著時(shí)代的發(fā)展，人們對(duì)居住環(huán)境的要求越來越高，期待株型豐富、花色花型多樣、花期長、適應(yīng)性強(qiáng)且應(yīng)用范圍廣的茶梅新品種。分析茶梅品種資源的親緣關(guān)系，對(duì)于茶梅新品種的培育工作具有重要的指導(dǎo)意義。雖然目前的茶梅品種已相當(dāng)豐富[1]，但大多數(shù)品種的花期都集中為10月—翌年4月，如果能培育出早于10月的早花品種或晚于4月的晚花品種，將會(huì)推動(dòng)茶梅雜交育種工作向前發(fā)展。目前，花期育種也是長期育種工作中的一個(gè)重要目標(biāo)，岳長平等[24]就以‘滿天紅’為母本，以‘迎春’為父本，雜交培育出‘嫣紅早花’的桃花新品種，不僅使‘嫣紅早花’的末花期提前了，還使得其花期的持續(xù)時(shí)間比其父母本品種的更長；王召元等[25]以‘重陽紅’為母本，以‘燕紅’為父本，雜交育成‘秋戀’的晚熟桃新品種，延遲了其花期和果實(shí)成熟期。供試的茶梅品種中，‘茶梅原種’‘葡萄酒’‘初光’‘棉花糖’‘酒中花’‘朝中鶴’‘虹’‘天女舞’均為早花品種，因此，可以在這8個(gè)品種之間進(jìn)行雜交培育，以嘗試選育出新的早花品種；而‘東牡丹’‘丹玉’‘久富’‘笑顏’均為晚花品種，如果在這4個(gè)品種之間進(jìn)行有選擇性的雜交培育，也有可能培育出新的晚花品種。

要想培育出品質(zhì)優(yōu)良的茶梅品種，先要了解品種之間的遺傳背景。在選配親本時(shí)，通常同一類品種的親緣關(guān)系較近，不利于選育出優(yōu)良新品種；但若類群間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，基因型差異較大，則后代分離較為廣泛，因此可以選擇不同類群之間的品種作為親本材料進(jìn)行雜交，從而培育出優(yōu)良的雜交后代。本研究在觀察34個(gè)茶梅品種形態(tài)學(xué)性狀的基礎(chǔ)上，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，區(qū)分了34個(gè)茶梅品種的體系，研究結(jié)果可為茶梅品種的鑒別及雜交育種提供理論依據(jù)。

相比于TRAP（靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性）、SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）等新型分子標(biāo)記技術(shù)[26-28]，本研究所采用的ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已被納入傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù)當(dāng)中，加之遺傳因子的多樣性，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究品種間的遺傳親緣關(guān)系會(huì)受到一定程度的限制，因此，后續(xù)研究可以結(jié)合利用TRAP及SRAP標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)一步梳理并明確茶梅品種間的親緣關(guān)系和遺傳背景。依據(jù)研究發(fā)現(xiàn)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種，開展種間雜交育種工作，以選育優(yōu)良的早花和晚花茶梅新品種，這是今后研究的方向之一。

致謝：感謝中國科學(xué)院昆明植物研究所王仲朗研究員對(duì)茶梅品種的詳細(xì)介紹及取樣時(shí)給予的幫助。