酯化酶用于酒廠黃水酸性成分再利用的研究進展

江曉欽,唐羽翼，張立，黃張樂，番自琰，韓磊，梅冰*

（1.云南農業大學 建筑工程學院，云南昆明 650000；2.云南農業大學 資源與環境學院，云南昆明 650000；3.四川溢陽環保設備技術工程有限公司，四川成都 610041）

白酒是我國特有的一種蒸餾酒，由原料中的淀粉以及糖類在酒曲的發酵作用下生成。黃水則是在白酒發酵過程中，沉積在窖底的一種具有高COD、BOD的棕黃色、黏稠的有機廢水。黃水中含有較多的酸、酯、醇、醛等香味物質，特別是有機酸含量豐富。但黃水雜味較重，且蛋白質、菌體自溶物及果膠質含量較多。

工業上處理黃水主要是用清潔水對黃水進行稀釋，并與生產過程中的其他高濃度有機廢水混合后進行統一處理。后續的處理工藝主要是利用厭氧處理工藝降低COD和BOD，再用好氧處理工藝去除磷酸鹽和氨等。已應用于工程實踐且取得較好效果的高濃度有機廢水工程治理措施有“水解酸化 +IC+CASS+BAF”工藝[1]、“ABR+SBR”工藝[2]、“UASB-SBR-陶粒過濾”工藝[3]、“AF-ABR-氣浮-CASS”工藝[4]等，均可實現廢水的達標排放。

但以上處理方式存在一定的水資源浪費以及處理成本過高的問題。因此，如能對黃水中的酸性成分進行有效利用，對于企業而言，在減少高酸廢水的處理成本的同時還可以避免資源浪費，提高收益，意義重大。

1 黃水中的酸性成分

黃水是酒廠在生產過程中產生的高酸液體，含有大量的脂肪酸，直接排放將對環境造成嚴重的污染。研究發現酯化酶可將黃水中的酸轉化成脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯，可用于酒的調香及生產。黃水中其他的有機成分為小分子糖、酸、醇和脂類物質，其中主要的酸性成分有乳酸、甲酸、己酸和乙酸，不同酒廠的黃水中酸性成分的含量有一定差異。盛杰等[5]對江蘇某酒業生產的黃水進行分析，結果表明其中乙酸含量最多，為7 375.8 mg/L，其次為甲酸。從黃水中豐富的有機酸性成分來看，將其酸性成分進行再利用，可以有效降低黃水中的COD和BOD，從而降低酒廠廢水處理難度與處理費用。

2 酯化酶對黃水中酸性成分資源化的利用

濃香型白酒窖內發酵過程中產生的主要液態副產物為黃水，不僅含有豐富的濃香型白酒風味（前體）物質（如醇、醛、酸和酯類等），還含有豐富的營養物質（如淀粉、還原糖、酵母自溶物等），以及大量經長期馴化的釀造微生物。當前，黃水一方面可用于人工窖泥生產、養窖護窖，另一方面可利用黃水中豐富的風味（前體）物質提高原酒品質或生產新型白酒。將復合生物制劑應用在濃香型白酒黃水酯化中，反應后丁酸乙酯及己酸乙酯含量均大幅上升；利用紅曲霉或酵母制成的各種酯化酶粗酶制劑對黃水進行酯化，黃水中的酯含量大幅上升，香味物質含量高[6-8]。

酯化黃水酸性成分的酯化酶主要包括脂肪酶、酯合成酶、磷酸酯酶。酯化酶分為胞外酶與胞內酶，胞外酶制備粗酶液可直接進行離心取上清，胞內酶則需進行細胞破碎再離心取上清。通過酯化酶的作用，黃水中的乙酸、己酸、乳酸以及醇類轉化為乙酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯等白酒中的主體香味成分。應用于黃水酸性成分處理的酯化酶一般來源于釀酒大曲中具有較強產酯化酶能力的菌株。對菌株產酯化酶的最適條件進行試驗，通過最大酶活力值來衡量該菌株的酯化能力。細菌、真菌、酵母都可具有產酯化酶能力，侯小歌等[6]發現一部分放線菌也具有產酯化酶能力。目前的研究表明，具有較強酯化能力的菌株主要為紅曲霉屬（Monascusspp.），如血紅紅曲霉（Monascus sanguineus）X1，其酯化酶活力可達315.19 U/mL；紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018酯化酶酶活最大可達919.12 U/mL[7-8]。此外紅曲霉Hm、紅曲霉MZ-1、紅曲霉H-7、紫色紅曲霉LZLJ2103、紫色紅曲霉YJX-8、紫色紅曲霉EM-56、黑曲霉（Aspergillus niger）T206、黃曲霉（Aspergillus flavus）、、橙色紅曲霉（Monascus apelsin）、青鏈霉菌（Streptomyces lividans）、藍色鏈霉菌（Streptomyces azureus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、傘 狀 毛 霉（Lichtheimia corymbifera）、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、伯克霍爾德氏菌（Burkholderiasp.）X10、橫 梗 霉（Lichtheimia）HSM、地衣芽胞桿菌（Bacilluslicheniformissp.）G2、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）都具有一定的酯化能力。

經過酯化酶催化轉化后生成的黃水酯化液，其COD和BOD含量相比黃水可下降80%左右[7-8]，能直接進行后續的生化處理，無需稀釋，節省成本。酯化液中含有大量的脂類及微生物，在提高成品酒品質的同時還可以縮短釀造白酒的發酵周期。因此，酯化液可應用于釀酒的主發酵期后，與低度酒尾按一定比例配合灌入酒窖內進行二次發酵，或在蒸餾丟糟酒前倒入底鍋內串蒸。酯化液也可直接進行脫色制成調味酒。

3 酯化酶催化活性的影響因素

酯化酶對黃水中酸性成分的催化活性受到酶的自身活力、酶的濃度、底物濃度、溫度、pH、外源物質等諸多因素的影響。

3.1 底物濃度

在生化反應中，若酶的濃度為定值，底物的起始濃度較低時，酶促反應速度與底物濃度成正比；當初始底物濃度較高時，提高底物濃度對加快反應速率的效果降低；當底物濃度達到酶的最大處理極限時，提高底物濃度對反應速率沒有影響。唐取來等[9]的研究表明，當底物中乳酸質量濃度較低時（低于8 g/L)，大曲中的酯化酶表現為合成作用，催化乙酸乙酯的合成；隨乳酸質量濃度的增加，大曲酯化酶的合成作用減弱；當乳酸質量濃度較高時（高于16 g/L），酯化酶表現為水解作用，將酯分解為相應酸和醇，可能與酶的活性中心改變及底物的競爭抑制作用有關。張浩等[10]研究了己酸、乳酸、丁酸、乙酸的濃度對酯化酶催化的影響，結果表明，當己酸、乳酸、丁酸、乙酸的濃度分別為8 g/L、1 g/L、9 g/L和12 g/L時，大曲酯化酶催化效果最好。

3.2 酶濃度

酶濃度的影響主要體現在菌株的接種量對酶催化轉化黃水中酸性成分能力的影響。當菌株的接種量過低時，菌體數量少，催化能力較弱；當接種量過多時，則會快速消耗底物中的營養物質，并產生抑制酯化酶活力的代謝物。研究表明，傘枝犁頭霉的最適接種量為4%，紅曲霉H-7為1.5%，紫色紅曲霉FBKL3.0018為10%，傘狀毛霉為5%，紅曲霉Hm為10%[11-13]。

3.3 溫度

溫度對酯化酶的催化效果也具有一定影響。溫度與酯化酶本身基團的解離或者與底物的結合能力等具有一定相關性。據研究，酯化酶催化合成能力隨溫度升高而增強，但溫度過高時，酯化酶活力逐漸下降并最終失活，如黑曲霉酯化催化的最適溫度為30～36 ℃；紅曲霉酯化酶催化作用的最適溫度為30～40 ℃；傘狀毛霉和卷枝毛霉酯化酶催化作用的最適溫度為30 ℃；伯克霍爾德氏菌X10酯化酶催化作用的最適溫度為35 ℃；傘枝犁頭霉酯化酶催化作用的最適溫度為34 ℃；葡萄球菌酯化酶催化作用的最適溫度為37 ℃[12-16]。

3.4 pH

pH會對酯化酶的自身活性以及底物結構產生影響，從而影響酯化酶的催化能力。紅曲霉酯化酶催化作用的最適pH為4.5～6.5；傘狀毛霉酯化酶催化作用的最適pH為3.0；卷枝毛霉酯化酶催化作用的最適pH為3.5；伯克霍爾德氏菌X10酯化酶催化作用的最適 pH 為 6.5[11-15]。

3.5 外源物質

外源物質主要分為激活劑與抑制劑。葡萄糖可以作為速效碳源促進紅曲霉產酯化酶能力；新鮮酵母破壁液對紅曲霉產酯化酶具有誘導作用；乙醇與乳酸對酯化催化也具有促進效果；無水硫酸鈉可以通過吸水作用，使酶促反應平衡向右，提高酯化催化活力。胡娜等[11]發現低濃度的乙酸乙酯對酯化酶酶活力具有抑制作用，而當其含量為30%時，對酶活力起促進作用；低濃度K+、Ca2+對酯化酶催化反應有促進作用，而 Fe2+、Na+、Mn2+、Mg2+、Li+、Zn2+對酯化酶催化反應有抑制作用；表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）等對酯化酶活力也具有抑制作用[11,16-17]。

4 酯化酶用于黃水處理的效益分析

（1）企業經濟效益。黃水中添加酯化酶可大幅降低釀酒廢水中COD含量，節省稀釋用水費用，減少電力支出、設備損耗等，并一定程度上減少企業的排污費；同時酯化液可以用于二次發酵以及串蒸，減少制酒用曲量的同時提高酒的品質，增加收益。蔣學劍等[18]研究發現黃漿水用量40%、酒精度30%、己酸含量0.8%、酯化酶用量0.1%，每甑底鍋串蒸酯化液用量20 L，優級品率、一級品率均提高35%；在公司中試車間推廣使用黃水酯化液串蒸，每年可凈增加效益456.75萬元，達到了降低生產成本、增加經濟效益的效果。

（2）酯化液的直接經濟效益。劉賓等[19]研究表明，在乙醇體積含量為10%、己酸添加量1.5%、酯化酶用量7%、溫度30 ℃的條件下酯化7 d，濃香型白酒中的主要香味物質——己酸乙酯的含量大幅度提升，由91.9 mg/L增加至2 746.6 mg/L，可以生產出以濃香型白酒主體香味物質為主的高質量酯化液。

（3）間接減少制酒成本。王曉丹等[20]利用1株從濃香型大曲中分離篩選得到的合成己酸乙酯能力較強的酯化酶生產菌——紫色紅曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018，對其產酯化酶條件進行了初步優化，確定該菌株較理想的發酵產酶條件，將該條件下所產的粗酶制劑用于濃香型大曲酒的生產，減少了用曲量，提高了原酒產量和質量。束成忠等[21]研究表明，酯化酶按投料量的0.5%加入，按原加曲量的10%減曲，每1 000 kg原料效益增加304.08元。若每天投入10.8 t原料，每月可多實現效益98 521.92元，全年按10個月計算，每年可增加效益985 219.20元。且發酵期按正常發酵進行生產試驗，生產工藝不用改變，使用酯化酶，既提高了酒質，又降低了生產成本，帶來可觀的經濟效益。

（4）環境生態效益。酯化酶應用于黃水中生成酯化液，通過對黃水中酸性成分的有效利用，對于企業而言得到直接的經濟效益，此外還極大地減少了黃水對環境的危害，取得一定程度上的環境效益和社會效益。環境效益主要是利用釀酒副產物發酵可以使COD排放量得到控制，減少電力支出、設備損耗，減少人工支出，減少環境污染等。如劉子紅等[22]的研究結果表明，科學利用黃水有效成分可以降低10%環保處理費用。社會效益主要是循環經濟的利用，企業減少了大量的環境污染，樹立負責任企業形象，提升品牌形象，實現了資源的循環利用與綠色經濟發展。

5 展望

白酒釀造中酯化酶技術的應用是中國白酒工業的一項重大創新成果，該技術在濃香型白酒生產中的應用極大地提高了出酒率和優質酒率；突出了濃香型白酒己酸乙酯的主體香；酒體協調，促進了酯化反應；能夠在較高的酸度下正常發酵，利于酒體“潔凈”；較好地解決了酒質和出酒率的矛盾；有利于工藝穩定，提高生產效率；產酒醇甜，賦予成品酒良好的風味。

酯化酶使黃水酸性成分得到二次利用，降低酒廠廢水的處理難度，提高酒的品質與出酒率，為企業產生直接的經濟效益。該技術操作簡單，在最優條件下酯化酶的催化反應具有較強的穩定性，且無需改變釀酒的生產工藝及設備，利于企業的推廣。從經濟效益、環境效益以及社會效益角度來看，酯化酶應用于酒廠黃水處理具有較好前景。

白酒生產過程中相關的因素很多，與白酒質量相關的因素也很多，所以在應用時一定要對酯化菌株及其性質和生產進行細致的研究。在實際生產中合理利用多種方法，加強產酯微生物的資源挖掘、酯化酶純度提高、酒類酯類物質比例協調性調節及復合生物酯化酶制劑開發工作，以期進一步提高對黃水中酸性成分的利用，提高白酒品質。

目前的研究對新型高效的產酯化酶的菌株研究較少，且對菌株的最適產酯條件研究還不夠系統完善，酯化酶商業化產品尚缺。應加強對高效產酯化酶菌株的研究，并對酯化酶的生產和保存技術進行研究，以推動其商業化進程。