外泌體在糖尿病腎臟疾病發病機制中的作用研究進展

白雨，刁宗禮，劉文虎

（首都醫科大學附屬北京友誼醫院腎內科，北京 100050）

據統計，全球糖尿病患者超過4.15億，預計2040年將增長至6.42億[1]。近年來，我國糖尿病患病率逐年上升，約占全球糖尿病患者1/3[2]。糖尿病是一種復雜的異質性的糖代謝性疾病，主要表現為血糖升高，可出現多尿、多飲、疲勞、體質量減輕等典型癥狀，并可導致酮癥酸中毒或非酮癥高滲昏迷等急性并發癥[3]，慢性高血糖還可引起多器官或組織功能失調，包括心血管疾病、腎臟損傷、視網膜病變、周圍神經病變，皮膚損傷等[4]。其中，糖尿病腎臟疾病（DKD）是糖尿病最常見且最嚴重的慢性并發癥之一，30%～40%的糖尿病患者會發生DKD，最終發展為終末期腎病（ESRD），增加患者心血管事件、感染、住院和死亡的風險[5]，降低患者生存率，加重社會經濟負擔[6]。DKD是以尿白蛋白排泄持續升高：尿白蛋白/肌酐比值（UACR）＞30 mg/g或估算腎小球濾過率（EGFR）持續降低：＜60 ml/（min·1.73 m2）為特征的糖尿病相關慢性腎臟病，其病理改變包括腎小球肥大、系膜區增寬、腎小球基底膜增厚、腎小管基底膜增厚及分裂、腎小球硬化、Kimmelstiel-Wilson結節形成、腎小管間質炎細胞浸潤等[5]。目前，DKD的發病機制尚未完全明確[7]，需探尋其潛在治療靶點。外泌體（exosomes）是細胞分泌的囊泡，內含有RNA、DNA、蛋白及脂類等多種生物活性物質，可被運輸至其受體細胞并介導細胞間的通訊和信號傳導[8]。研究[9]證實，腎臟中內皮細胞、足細胞、系膜細胞和腎小管上皮細胞、免疫細胞等在高糖環境的刺激下可誘導外泌體異常分泌。由此可見，在腎臟中，由高糖刺激下不同細胞分泌的外泌體介導的細胞間信號溝通在DKD發展和腎功能降低中發揮關鍵作用[10-11]。本文針對外泌體在DKD發病機制中的作用研究進展進行綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的生成及調控 細胞外囊泡（EVs）是被脂質雙分子層包裹的一些生物活性物質的小泡，可根據直徑大小分為外泌體（直徑40～150 nm），微泡（＞150～1 000 nm）和凋亡小體（＞1 000 nm），外泌體及微泡統稱為非凋亡細胞外囊泡[12]。外泌體在分泌至細胞外前儲存于多泡體（MVBs）內，隨后形成晚期內體，最后與細胞膜融合后釋放至細胞外[13]。外泌體的產生和分泌過程十分復雜，其具體機制尚未完全明確。目前已知轉運所需的核內體分選復合體（ESCRT-III）形成螺旋，誘導囊泡出芽和分裂形成MVBs[14]，與病毒從宿主細胞內釋放的方式相似[15]。而RAB11、RAB27A和RAB31等小GTP酶參與MVBs與細胞膜融合過程[16]。在p53蛋白的調控下，細胞骨架的激活可調控外泌體的胞吞和胞吐[17]。此外，神經酰胺的形成在外泌體的形成過程中發揮重要作用，對外泌體內的生物活性物質發揮修飾作用[18]。

1.2 外泌體的作用方式 外泌體從母細胞脫落后可通過兩種方式發揮其生物學功能：一是與靶細胞表面的受體結合激活相應的信號通路發揮作用[19]；二是通過膜融合、內吞作用被受體細胞內化后通過其內含有的生物活性物質發揮多種生物學作用，如抑制凋亡[20]、促進炎癥[21]等。外泌體具體作用與細胞來源、靶細胞及微環境密切相關，不同的微環境及細胞來源可使外泌體的表面標志物及內容物具有一定特異性，這些外泌體被靶細胞攝取后可能導致特異的表型及功能改變[22]。此外，外泌體的攝取過程也會受到細胞因子的影響，如巨噬細胞激活后可分泌胰島素樣生長因子-1（IGF-1），促進內皮細胞對外泌體的吞噬[23]。

1.3 外泌體在DKD中的作用 研究[1]表明，外泌體與DKD的診斷、發病機制及治療關系密切。研究證實，糖尿病患者血清及尿液中外泌體與正常個體血清及尿液中外泌體存在差異，主要表現為外泌體中RNA水平差異，對外泌體RNA分析提示，miR-29c、miR-199-3p、miR-126、miR-770、miR-192、miR-126等可作為早期DKD潛在生物標志物[24-25]。在發病機制方面，腎臟中腎小球內皮細胞、足細胞、腎小管上皮細胞、系膜細胞、巨噬細胞等在病理狀態下通過外泌體進行細胞間信號轉導，造成靶細胞損傷，參與DKD的發生發展[26]。研究[27]發現，骨髓間充質干細胞（MSC）來源的外泌體可減輕高糖刺激的腎臟細胞及DKD動物模型的腎臟損傷，提示MSC來源的外泌體可作為DKD潛在治療手段，但其具體作用機制仍需進一步探究[28-30]。

2 不同細胞來源的外泌體在DKD發生機制中的作用

2.1 巨噬細胞來源外泌體 研究證實，巨噬細胞在DKD的發生發展中起重要作用。腎臟損傷可募集并激活巨噬細胞，分泌細胞因子并與腎臟細胞相互作用。研究證實，巨噬細胞在高糖刺激下外泌體產生增加[31]。Zhu等[32]在體外用高糖刺激巨噬細胞產生的外泌體刺激腎小球系膜細胞，導致系膜細胞活化增殖，細胞外基質，如4型膠原（Col-IV）、纖連蛋白（FN）、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）分泌增加。向C57BL/6小鼠體內注射高糖刺激巨噬細胞產生的外泌體后，腎臟病理可見系膜擴張和增殖，免疫組織化學染色提示腎組織巨噬細胞浸潤和系膜區細胞外基質沉積。研究發現，高糖刺激巨噬細胞產生的外泌體中轉化生長因子β1（TGF-β1）和Smad3的mRNA水平較對照組顯著升高，而用siRNA抑制巨噬細胞TGF-β1的表達后，外泌體中的TGF-β1水平降低，系膜細胞增殖驗證反應減輕，提示高糖刺激巨噬細胞分泌的外泌體在體內和體外通過TGF-β1/Smad3途徑激活腎小球系膜細胞[32]。Ding等[33]發現，在體外用高糖刺激后巨噬細胞分泌的外泌體刺激足細胞，可增加足細胞內活性氧產生和炎癥激活。高糖刺激后巨噬細胞來源的外泌體內miRNA-21-5p的表達水平增高，降低足細胞中抗炎因子A20表達從而誘導足細胞損傷，這一機制在鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病小鼠中也得到證實。高糖刺激巨噬細胞產生的外泌體不僅作用于足細胞、系膜細胞等腎臟細胞，還激活正常巨噬細胞產生炎癥反應。Zhu等[31]發現，將高糖刺激巨噬細胞產生的外泌體加入正常巨噬細胞中使其激活并促進核轉錄因子（NF-κB）、TNF-α、IL-1β、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）表達。將高糖刺激巨噬細胞產生外泌體經尾靜脈注射至正常小鼠體內，可觀察到小鼠腎臟明顯的系膜擴張和增殖，腎組織NF-κB表達水平升高，提示高糖處理的巨噬細胞分泌的可能激活巨噬細胞，并通過NF-κB p65信號通路加速腎損傷。

2.2 腎小管來源外泌體 腎小管損傷在DKD的發生發展中占據重要地位。腎小管上皮細胞在受到高糖刺激后發生一系列病理改變，并與其他細胞相互作用，加重腎臟損傷[34-35]。研究[36]證實，高糖環境下腎小管來源的外泌體可對腎臟細胞產生影響。

Jia等[36]研究發現，高糖刺激腎小管上皮細胞HK-2后產生的外泌體刺激正常的腎小管上皮細胞會導致其纖維化改變。而用長效胰高血糖素樣肽1（GLP-1）類似物艾塞那肽（Exendin-4）預處理高糖刺激的HK-2細胞后產生的外泌體刺激正常腎小管上皮細胞，可減少FN和1型膠原（Col-I）分泌，且Exendin-4可通過p53依賴方式降低HK-2細胞及外泌體內miR-192，改善纖維化改變，該實驗結果提示Exendin-4可通過抑制腎小管上皮細胞分泌miR-192改善高糖誘導纖維化。王東等[37]用高糖刺激腎小管上皮細胞，收集腎小管上皮細胞來源的外泌體，與巨噬細胞共培養后發現，高糖環境下腎小管上皮細胞分泌的外泌體可通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/NF-κB信號通路誘導巨噬細胞激活和功能改變。Hu等[38]發現，高糖聯合醛固酮刺激腎小管上皮細胞HK-2產生的外泌體與腎臟腎纖維細胞共培養可加重成纖維細胞的激活和纖維化，miRNA測序發現，高糖聯合醛固酮刺激后HK-2細胞產生的外泌體中miR-196b-5p水平顯著增加，進一步研究發現，miR-196b-5p可抑制細胞因子信號轉導抑制因子2（SOCS2）表達并增強轉錄激活因子3（STAT3）磷酸化，促進成纖維細胞功能異常及纖維化。該研究還發現，DKD患者的血漿miR-196b-5p水平高于非DKD患者，并與蛋白尿濃度呈正相關。與非DKD患者相比，糖尿病患者的腎臟標本中，主要位于腎小管上皮細胞的miR-196b-5p的表達增加。該研究提示腎小管上皮細胞外泌體來源的miR-196b-5p在DKD纖維化中發揮重要作用。Wen等[39]發現，在體外用高糖刺激腎小管上皮細胞產生的外泌體刺激成纖維細胞NRK-49F可導致其增殖、形態學改變和FN、α-SMA和Col-I大量產生。該研究對外泌體進行蛋白質組學分析發現，與正常外泌體相比，高糖刺激后腎小管上皮細胞產生的外泌體有22個差異表達蛋白，生物信息學分析提示，蛋白烯醇酶1（Eno1）的表達與DKD密切相關。該研究提示高糖刺激腎小管上皮細胞產生的外泌體可促進纖維化，與Hu等[38]研究結果一致。

Rab27a是調節外泌體分泌的關鍵因子[40]，抑制Rab27a的表達可使細胞外泌體的分泌減少50%～70%[22]。此外，Rab27a敲除可改善小鼠的炎癥反應[41]。Li等[42]發現，高脂飲食聯合STZ誘導DKD小鼠腎組織和BSA刺激的HK-2細胞中，Rab27a、IL-6、TNF-α和COL-I的表達顯著增加。體外抑制Rab27a表達可減輕HK-2細胞的炎癥反應，進一步研究發現，抑制Rab27a可減少腎小管上皮細胞富含miR-26a-5p的外泌體分泌，提高細胞內miR-26a-5p濃度，并通過抑制陽離子轉運調控樣蛋白1（CHAC1）/NF-kB通路減輕DKD炎癥反應[42]。

上述研究證實，高糖刺激腎小管細胞可增加外泌體分泌，并通過被靶細胞內化，促進腎間質炎癥反應和纖維化，提示阻斷高糖環境下腎小管細胞外泌體的分泌及探究外泌體發揮損傷的作用機制，可為尋找DKD治療的靶點提供理論基礎。

2.3 系膜細胞來源外泌體 DKD的病理改變包括細胞外基質分泌過多及腎小球系膜擴張，逐漸擴張的系膜堵塞腎小球毛細血管導致腎小球組織完整性和腎功能受損，最終加劇腎小球纖維化和瘢痕形成[43]。Wang等[44]發現，高糖刺激腎小球系膜細胞產生的外泌體可導致足細胞損傷，且高糖刺激后，腎小球系膜細胞分泌的外泌體中TGF-β1表達水平較對照組顯著增加，進一步研究證實，腎小球系膜細胞來源外泌體通過TGF-β1/磷脂酰肌醇（PI3KAKT）通路導致足細胞損傷，而小檗堿預處理足細胞可減輕上述損傷。Tsai等[45]發現，db/db小鼠及2型糖尿病患者尿液中分離的外泌體miR-15b-5p水平升高，且與UACR水平正相關，同樣，體外高糖刺激腎小球系膜細胞后miR-15b-5p水平升高，而miR-15b-5p可通過降低其靶蛋白BCL-2表達水平誘導系膜細胞凋亡，但該實驗未進一步提取系膜細胞來源外泌體進行成分分析及其對靶細胞的影響。

2.4 內皮細胞來源外泌體 腎小球內皮細胞功能障礙是DKD發生最早的病理改變，可能通過旁分泌作用導致其他腎臟細胞損傷[46]。外泌體是內皮細胞與腎臟其他細胞溝通的介質。Wu等[47]發現，高糖刺激腎小球系膜細胞后外泌體分泌增多，這些外泌體可被足細胞內化，導致足細胞發生上皮間充質轉分化和屏障功能障礙，進一步研究發現，在高糖刺激腎小球系膜細胞分泌的外泌體中，TGF-β1和Wnt/βcatenin水平較對照組顯著增加，提示TGF-β1和Wnt/β-catenin可能與足細胞功能障礙相關。Wu等[48]研究還發現，高糖刺激腎小球系膜細胞分泌的外泌體可通過TGF-β1/Smad3信號通路促進腎小球系膜細胞中α-SMA表達、增殖和細胞外基質蛋白分泌，提示高糖環境下腎小球內皮細胞來源的外泌體可激活腎小球膜細胞并促進腎臟纖維化。

2.5 足細胞來源外泌體 足細胞損傷是DKD的典型病理改變之一，在DKD的發生發展中占據重要地位。Munkonda等[49]研究證實，損傷的足細胞產生的外泌體可通過p38 MAPK和CD36途徑刺激腎小管上皮細胞轉分化，提示足細胞來源的外泌體會作用于腎小管上皮細胞發生相應的病理變化。Su等[50]發現，高糖刺激足細胞后產生的外泌體可使腎小管上皮細胞發生轉分化。高糖刺激足細胞來源的外泌體內miR-221表達顯著增加，miR-221的靶蛋白Dickkopf相關蛋白2（DKK2）是Wnt信號通路抑制劑，miR-221表達升高可引起Wnt/β-catenin通路水平升高，促進腎小管上皮轉分化。抑制miR-221可降低腎小管上皮細胞內Wnt/β-catenin表達水平，減輕細胞損傷。該研究提示高糖刺激后足細胞來源的外泌體通過microRNA-221介導DKD腎小管細胞的轉分化。

3 小結

DKD是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，在臨床中DKD患者腎活檢中發現的最經典的病理改變為彌漫性和結節性系膜擴張和腎小球基底膜增厚[51]。同時，腎小管間質病變也參與疾病的發展，包括腎小管萎縮、間質炎癥和腎小管間質纖維化[35]，與腎功能喪失密切相關。因此，腎小球內皮損傷、足細胞損傷、系膜細胞功能異常和腎小管間質損傷等病理過程在DKD的發生發展中發揮重要作用。

在糖尿病環境下，腎臟細胞間的相互作用機制尚未明確。外泌體是細胞間溝通的重要途徑，探究細胞間外泌體的信號傳遞對研究DKD的發病機制具有重要意義。目前外泌體在DKD發生機制中的研究多與腎小管上皮細胞及巨噬細胞相關，提示高糖或蛋白刺激后腎小管上皮細胞或巨噬細胞來源的外泌體會加重腎臟損傷，而內皮細胞、足細胞及系膜細胞相關的研究較少，需進一步實驗探究外泌體在糖尿病腎小球病變中的作用。此外，目前大部分研究為體外實驗，證實高糖刺激后腎臟細胞外泌體發揮的作用，需進行相應的在體實驗以深入探究不同細胞來源的外泌體在DKD發病機制中的作用。