疼痛抑郁共病動物模型及評價方法研究進展

何仁可,魯 程,陳 薇,汪萌芽,徐愛萍

(1.皖南醫學院細胞電生理研究室,蕪湖 241002;2.皖南醫學院啟明星小組,蕪湖 241002)

疼痛是一種與實際或潛在的組織損傷相關的不愉快的感覺和情緒情感體驗［1］，是機體的一種適應性和保護性感受。但疼痛同時也可對身體機能、心理健康和社會功能產生不利影響［2］。臨床研究發現，40%～60%的慢性疼痛患者伴有明顯的抑郁癥狀［3-4］，而抑郁情緒的積累會增加患者的疼痛感受，造成一種惡性循環，這就是疼痛抑郁共病［5］。該疾病不僅對患者的身心健康造成了嚴重的傷害和打擊［6］，還極大地加重了其在家庭和社會的各種負擔［7］。因此，探討疼痛與抑郁共病的發病機制及治療方法具有重要價值和社會意義。基于目前國內外疼痛抑郁共病的研究現狀，亟需建立合適的疼痛抑郁共病動物模型來全面了解疼痛抑郁共病的發生機制及其治療方法。本文對疼痛抑郁共病的動物模型及其行為學評價方法進行綜述。

1 疼痛抑郁共病動物模型的建立

1.1 完全弗氏佐劑致痛模型

完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）由石蠟油和滅活的卡介苗配制而成。目前，通常在動物的足底、肌肉和關節處注射CFA以模擬急性或慢性炎癥致痛相關的疾病，這種動物模型廣泛用于探究藥物抑制炎癥或減輕疼痛的療效觀察實驗中。

將CFA注射到動物的足底，可造成組織的局部炎性反應［8］。通常在注射1 d后，動物注射部位開始出現腫脹、痛覺敏化等癥狀，這些癥狀可持續7周之久［9］。Zhou等［10］研究發現，采用此法造模4周后，動物開始出現抑郁樣行為，具體表現為糖水偏愛指數下降，強迫游泳實驗和懸尾實驗中“不動時間”延長等。

除了將CFA注射到足底，還可將CFA注射到動物踝關節腔中［11］。該造模部位首先出現急性炎癥表現，如紅腫、痛閾下降、運動功能減退等；3周后表現為慢性炎性反應特征，運動功能障礙進一步加重，動物熱痛縮足潛伏期縮短，痛覺敏化程度加深；同時，動物糖水偏愛指數下降，表現出抑郁樣行為。研究發現，這種模型動物的患處可出現明顯的機械性痛覺過敏和熱痛覺過敏行為反應，可能與踝關節腔注射CFA引起的外周炎性反應有關，即腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-β）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等促炎因子水平明顯升高，且促炎因子透過血腦屏障進入大腦，在中樞引起炎性級聯反應，最終表現出疼痛和抑郁樣行為［12-13］。

CFA致痛模型具有病灶局限、痛覺敏化維持時間較長、模型重復性好等優點，是目前慢性關節炎最常用的模型之一。

1.2 脊神經結扎模型

麻醉動物后，在左側腰椎4～5節段沿脊柱切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露出第6腰椎橫突，采用4-0醫用縫線在近端結扎第5脊神經，然后剪斷遠端，最后縫合肌肉和皮膚［14］。術后當日即可出現機械性痛覺過敏和熱痛覺過敏，并且持續至少3個月；15 d后出現抑郁樣行為，30 d時抑郁樣行為更加明顯，與假手術組比較，模型組動物糖水偏愛指數下降，強迫游泳實驗中動物“不動時間”延長。

有文獻報告，脊神經結扎模型會激活p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路和海馬中的小膠質細胞，同時伴有TNF-α、IL-1β、IL-10等細胞因子的異常變化［15］。這可能是脊神經結扎術后神經性疼痛、抑郁樣行為出現的分子機制。

脊神經結扎模型的優點是結扎部位和結扎強度變異小，盡可能排除了實驗操作誤差；缺點是該造模方法造成的組織創傷面相對較大，易發生感染，影響造模效果。

1.3 保留性神經損傷模型

該模型的造模手術較為簡便［16］。麻醉動物后，切開后肢外側面皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經、腓總神經和脛神經，用非吸收性4-0醫用縫線結扎腓總神經和脛神經，然后將神經橫切，并從該點切除約2 mm的神經，隨后縫合皮膚并用碘伏消毒。假手術分離肌肉，暴露神經后再縫合，保留神經完好無損。在操作過程中盡量避免牽拉和損傷腓腸神經，以免影響模型效果。術后當日模型動物即出現機械性痛覺敏化，持續2個月以上；4周后出現抑郁樣行為，維持時間可達8周以上，具體表現為糖水偏愛指數下降、強迫游泳“不動時間”延長。

研究表明，保留性神經損傷模型可引起下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸功能亢進，血清皮質酮含量增加；進一步研究發現，持續增加的皮質酮可導致炎性因子、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平改變［17］。

保留性神經損傷模型的特點是疼痛和抑郁樣行為持續時間長，并且行為學表現穩定。

1.4 坐骨神經慢性結扎損傷模型

麻醉動物后，暴露坐骨神經，在坐骨神經分叉前段，使用4-0醫用縫線沿神經間隔1 mm的距離進行4個松散結扎［18］。影響該模型效果的是結扎時的力度，當結扎時小鼠神經周圍的肌肉或腿出現了抖動，說明此時結扎的力度符合模型建立要求［19］；若結扎的力度過強或過弱，都有可能導致模型建立失敗。疼痛反應在造模1周后出現，表現為舔足、運動障礙、機械性痛閾下降等，2周疼痛反應達到高峰，痛覺過敏可持續8周以上。造模2周后可檢測出抑郁樣行為，表現為強迫游泳實驗中“不動時間”延長。

研究發現，在大鼠坐骨神經慢性結扎損傷模型中，大鼠脊髓背角谷氨酸受體6（glutamate receptor 6，GluR6）表達水平明顯升高，而預先鞘內注射GluR6 siRNA不僅能顯著抑制大鼠脊髓GluR6的表達，還能減輕模型動物的神經病理性疼痛［20］。

坐骨神經慢性結扎損傷模型的缺點是結扎的力度難以維持一致，造成神經損傷程度不易控制。

1.5 坐骨神經部分結扎模型

坐骨神經部分結扎模型制作與坐骨神經慢性結扎損傷模型相似。麻醉動物后，暴露坐骨神經前段，結扎坐骨神經前段1∕3～1∕2。結扎標準是結扎的力度使神經的直徑幾乎沒有收縮。假手術分離肌肉，暴露坐骨神經再縫合，不結扎神經。術后第2天模型動物出現機械性痛覺過敏，可持續1個月；2周后出現抑郁樣行為，表現為強迫游泳實驗中“不動時間”延長和飛濺實驗中“梳理時間”減少［21］。

研究發現，坐骨神經部分結扎小鼠模型中小膠質細胞被激活，導致神經炎性反應，活化的小膠質細胞釋放多種促炎細胞因子和趨化因子，誘導小鼠大腦皮層和海馬活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）含量、一氧化氮（NO）含量和脂質過氧化水平升高，最終使神經元敏感性提高，出現疼痛和抑郁樣行為［22］。

坐骨神經部分結扎模型的缺點是手術難度大，動物神經結扎的力度難以控制一致，影響模型的效果。

2 疼痛抑郁共病動物模型的評價

2.1 痛覺評價

2.1.1 機械性縮足閾值測定

該方法通過直接刺激動物后肢皮膚，觀察機械性痛閾的變化。具體操作：動物提前適應測試環境3 d后，置于一個高架網狀地板上的透明塑料盒內，測試前需適應30 min；動物安靜后，按刺激強度由小到大的順序，將Von Frey纖維絲垂直施加于患側后肢，使細絲彎曲成S形；相同的刺激強度重復測量5次，當5次試驗中動物有3次出現足回縮反射時，該刺激強度即動物的機械性痛閾［23］。當引起動物縮足反射的閾值明顯下降，提示動物出現機械性痛覺敏化。

2.1.2 熱輻射法熱痛縮足潛伏期測定

該方法主要檢測動物特定皮膚區域對溫度刺激的反應。具體操作：動物提前適應測試環境3 d，環境溫度保持在（24±1）℃，測試時將動物放置在測試平臺的透明塑料盒內，適應1 h后開始實驗；將熱輻射光源發射中心對準動物后足底，自照射開始起計時，記錄第一次抬起后肢的時間，即縮足反射潛伏期［24］。每只動物重復測試5次，間隔時間不少于5 min。20 s為最大測量值，以防止熱輻射時間過長造成受傷。當引起動物縮足反射的時間減少，提示動物出現熱痛覺敏化［25］。

2.1.3 熱板實驗熱痛反應潛伏期測定

該方法主要檢測動物局部皮膚區域對溫度刺激的反應。具體操作：動物被放置在一個熱板上，溫度調整為（52±1）℃，測試時環境溫度保持在（24±1）℃［26］。自開始加熱計時，記錄第一次傷害性反應（舔爪子、縮足）出現的時間，即局部熱痛反應潛伏期。每只動物重復測試3次，間隔時間不少于15 min。最大測量值為45 s，以防止熱輻射過量造成受傷。當引起動物縮足反射的時間減少，代表動物出現熱痛覺敏化［27］。

2.1.4 光輻射熱甩尾反應潛伏期測定

該方法同樣是檢測動物對溫度刺激的反應。具體操作：測試時環境溫度保持在（24±1）℃，用光輻射熱測痛儀對實驗動物進行不同光照強度下甩尾反應潛伏期的測定，即在距離鼠尾根部1 cm處這一固定點進行不同光照強度下的熱輻射，然后測定動物甩尾潛伏期，分析不同光照強度和甩尾潛伏期之間的關系［28］。每只動物重復測試5次，間隔時間不少于5 min。20 s為最大測量值，以防止熱輻射造成受傷。當動物甩尾反應潛伏期縮短，代表動物出現熱痛覺敏化［29］。

2.2 抑郁樣行為檢測

2.2.1 糖水偏愛實驗

抑郁的核心癥狀之一是快感缺失，具體指對愉快的刺激缺乏反應，或對愉快的體驗能力下降。糖水偏愛實驗是檢測嚙齒類動物抑郁樣行為最經典的實驗之一［30］。當動物快感缺失、出現抑郁樣行為時，其糖水偏愛指數會顯著降低［31］。實驗分為適應期和檢測期，整個實驗期間動物單籠飼養，并且配備2個水瓶。適應期第1天給予動物2個裝有1%蔗糖水的水瓶，適應期第2天用1瓶純水代替1瓶蔗糖水。適應期結束后，禁食禁水一晝夜左右，然后給予動物1瓶1%蔗糖水和1瓶純水，并且同時給予充足的飼料。1 h后交換水瓶位置，2 h后檢測結束，稱量糖水和純水的消耗量［32］。糖水偏愛指數（%）=糖水消耗量∕（糖水消耗量＋純水消耗量）×100%。此實驗可在造模前后檢測或治療前后檢測，每兩次檢測應間隔1周以上。

2.2.2 強迫游泳實驗

這是一種行為絕望測試，根據動物的絕望程度評估其抑郁狀態［33］。具體操作：取圓柱形玻璃容器，注入足夠淹沒動物的水，將動物置于其中，用攝像頭記錄其6 min內的活動情況。分析指標為首次出現不動狀態的潛伏期、后4 min內處于不動狀態的時長等。當動物靜止漂浮在水面，或僅有尾巴和前爪輕微擺動以保持身體平衡，視為其處于不動狀態。考慮到該實驗對動物的刺激較大，盡量在造模結束后進行單次實驗以檢測造模是否成功。

2.2.3 懸尾實驗

這也是一種行為絕望測試［34］。該實驗在黑暗、安靜的環境中進行，將動物尾部1 cm處固定，懸掛于25 cm×25 cm×30 cm箱子中，使動物頭部距離底面約5 cm，用攝像頭記錄小鼠6 min內的活動情況。分析指標為后4 min內小鼠的不動時間［35］。與強迫游泳實驗類似，通常在造模結束后進行單次實驗。

2.2.4 飛濺實驗

動物的梳理行為被認為是自我護理和動機評價的指標之一，在一定程度上能反映抑郁癥的核心癥狀。飛濺實驗的具體操作：將10%蔗糖溶液噴在每只動物的背部，并記錄動物開始出現梳理活動的潛伏期以及5 min內的梳理活動（包括鼻∕臉梳理、頭部清洗和身體梳理）［36］。抑郁癥模型動物會表現出潛伏期增加，梳理活動時間減少。

2.2.5 新物體識別實驗

該方法能夠檢測動物對新奇物體的探索偏好［37］。實驗分為適應、熟悉、測試3個階段。適應階段：不放置任何物體，讓動物熟悉測試環境（在曠場測試箱內實驗）5 min。熟悉階段：24 h后在測試箱一側放置2個相同物體，大鼠在箱的另一側背對物體，放入后開始錄像共10 min。測試階段：在熟悉階段結束24 h后，將其中一個物體換為新物體，測試時間為5 min。記錄指標為新物體的探索時間和舊物體的探索時間［38］，相對辨別指數（%）=（探索新物體的時間－探索舊物體的時間）∕（探索新物體的時間＋探索舊物體的時間）×100%。抑郁癥模型動物較正常動物探索新物體的時間短，相對辨別指數下降。

2.2.6 新奇抑制攝食實驗

抑郁癥動物表現為對食物攝入興趣降低、食欲下降，該實驗可通過觀察動物攝食行為以反映動物的情緒狀態［39］。以小鼠為例，剝奪食物24 h后，將小鼠放置在從未探索過的開放式競技場（40 cm×40 cm×30 cm）的角落，中心有3顆實驗食物，測量小鼠開始進食的潛伏期；然后，將小鼠放回原飼養籠內，在其中放入3顆食物，再次測量小鼠在飼養籠內的攝食潛伏時間以及在5 min內攝取的食物量［40］。

2.2.7 社會交互實驗

該實驗主要檢測動物的社交回避行為［41］。分為兩個階段：第一階段，動物被放置在一個開放競技場（44 cm×44 cm×44 cm）中自由活動，競技場的一側放置一個空的金屬籠（9.5 cm×9.5 cm×8.0 cm），籠子周域5 cm范圍內視為交互區；第二階段，將一只具有攻擊性的CD1小鼠放入金屬籠中，將實驗動物放回開放競技場，記錄動物在交互區停留的時間。社交互動指數（%）=交互區停留時間∕（總時間－交互區停留時間）×100%。抑郁癥模型動物表現出社交互動指數下降。

3 結語與展望

疼痛抑郁共病的發病率呈逐年上升趨勢，影響甚廣。目前臨床上對于該類共病的治療手段主要包括傳統的抗抑郁藥物和鎮痛藥物，但其治療效果不盡如人意，因而受到越來越多研究者的關注。臨床影像學資料顯示，疼痛抑郁共病患者的多個腦區結構發生了異常變化，如伏隔核和前扣帶回等發生了不同程度的萎縮［42］，并且部分腦區之間出現功能連接的異常［43］。基礎研究發現，許多參與疼痛發生的腦區在調控抑郁癥中同樣起著重要作用，例如海馬、前額葉和杏仁核等［44］，提示疼痛和抑郁癥可能存在共同的神經生物學機制，但更具體的機制尚不明確，亟待研究。

目前，為盡可能模擬臨床上疼痛抑郁共病患者的病理生理改變，國內外主流應用的疼痛抑郁共病動物模型有炎性疼痛致抑郁模型和神經病理性疼痛致抑郁模型。從文獻分析來看，疼痛抑郁共病模型發生的病理生理學機制各不相同，炎性疼痛抑郁共病模型主要模擬臨床上慢性炎癥患者，而神經病理性疼痛抑郁共病模型主要模擬臨床上神經損傷患者。絕大部分神經病理性疼痛模型是在脊神經、坐骨神經及其相關神經上進行操作，例如坐骨神經慢性結扎損傷模型將坐骨神經結扎壓迫，保留性神經損傷模型將坐骨神經切斷。這些模型的特點是能夠迅速地導致機械性痛閾和熱痛閾的下降，并且很好地誘發抑郁樣行為。深入研究顯示，疼痛抑郁共病的分子病理機制主要包括外周損傷致外周炎性因子透過血腦屏障進入大腦，引起HPA軸功能亢進或中樞神經的炎性反應等［45］。這與臨床資料相一致，但仍需要更細致的研究探討。

同時，文獻中評價疾病動物模型的行為學參數也與臨床上疼痛抑郁共病患者的疾病表現相契合，包括痛覺的檢測和抑郁樣行為的檢測。本文總結歸納的痛覺檢測方法及指標有機械性縮足閾值、熱輻射法熱痛縮足潛伏期、熱板實驗熱痛反應潛伏期和光輻射熱甩尾反應潛伏期等。抑郁樣行為檢測方法有糖水偏愛實驗、強迫游泳實驗、懸尾實驗、飛濺實驗、新物體識別實驗、新奇抑制攝食實驗和社會交互實驗等。以上均是經典的行為學實驗，深受國際認可，廣泛運用于各個實驗室。

疼痛抑郁共病動物模型可以為疼痛抑郁共病的發病機制和治療提供有價值的信息，建立合適的動物模型是了解疼痛抑郁共病病理生理學機制并進行新藥開發不可缺少的一部分。理想的疼痛抑郁共病動物模型應具有以下優點：易操作、造模成功率高、與臨床一致性高等。但多數模型只能模擬疼痛抑郁共病中某一或某些方面的癥狀，并且各種癥狀都存在時效性，超過一定時間模型就可能失效或者自愈，只能出現暫時性而非永久性的疾病狀態，無法完全模擬疼痛抑郁共病患者的真實狀態，難以達到實驗的目的。同時，在建立動物模型時，實驗人員的操作手法以及熟練度也是模型成功與否的關鍵，例如在神經病理性模型中，結扎的部位和結扎的力度影響著成模的效果。因此，要根據各種動物模型的特點、適用范圍以及實驗研究目的來設計、選擇合適的動物模型。此外，應繼續改良或開發與臨床表征更為貼切的疼痛抑郁共病模型，為揭示疼痛抑郁共病的發病機制、研發治療藥物提供更有價值的依據。

[作者貢獻]

何仁可：負責資料的收集與整理、論文的撰寫與修訂；

魯程、陳薇：資料的收集與整理；

汪萌芽、徐愛萍：文章質量控制與審核。

[利益聲明]所有作者均聲明本文不存在利益沖突。