響應面法優化改良米酒工藝研究

田夢銀，王青青，嚴丹雨，周鴻翔

（貴州大學釀酒與食品工程學院釀酒工程系，貴州貴陽 550025）

米酒（rice wine）又稱酒釀、甜酒，舊時稱“醴”，用糯米釀制，是我國傳統的酒精飲品，通常用蒸熟的糯米拌上糖化發酵劑發酵而成。傳統方法釀造的米酒工藝簡單，口味鮮醇甜美，含酒精量較低，具有濃郁的米酒風格，是很多人日常飲用的飲品[1]。但在當今社會，由于其風味陳舊老派、口感單一、色澤黯淡，消費人群日益萎縮，逐漸與時代脫節，缺乏市場競爭力。日本清酒是借鑒中國黃酒的釀造法而發展起來的日本國酒，主要工藝特點是要求大米外層剝去越徹底越好，米外側的蛋白質、脂肪等成分比較多，用于釀酒有損香氣和色澤，難以釀出好清酒。大米經研磨除去外皮后,大大減少了米中蛋白質、脂肪等含量,浸漬時米粒吸收水更均勻、更快速，蒸飯時米粒易糊化,有利于提高酒的品質[2]。清酒釀造的微生物為兩大類，制曲時用的是米曲霉，釀酒用微生物是清酒專用酵母，釀造時采用低溫、開放式并行復發酵的方式[3]。釀制好的清酒入口清爽，口味清雅，酒液呈微黃色或無色，清亮透明。因此，將日本清酒的精米、低溫、開放式并行復發酵的工藝與中國傳統米酒發酵工藝相結合，可得到一種風味協調、無色透明、無任何添加劑、操作簡便的改良米酒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：糯米（貴州茅貢米業有限公司）；酒曲（四川達州大竹東柳植物甜酒曲、蘇州蜂蜜牌甜酒曲、安琪甜酒曲、雅大牌高產酒曲）；酵母（異常威克漢姆FBKL2.00K8 由貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室提供）。對照酒樣：米色米酒（6%vol），市場采購。

試劑及耗材（除非另有說明，所使用試劑均為分析純）：麥芽糖；Agar Powder；WL 營養瓊脂；濃鹽酸；葡萄糖；3，5-二硝基水楊酸；氫氧化鈉；酚酞；山梨酸鉀（食品級）。

儀器設備：生化培養箱，上海博訊實業有限公司；S-10 生物傳感器分析儀，深圳市西爾曼科技有限公司；MB-RC52 精米機，日本山本電氣；紫外分光光度計，上海儀電分析儀有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米酒的制備工藝流程及操作要點

試驗采用工藝流程：糯米→挑選→精米→浸泡→清洗→蒸煮→加水→二次蒸煮→拌曲→糖化→酵母活化及添加、加水→發酵→過濾→后發酵→二次過濾→添加防腐劑→包裝→巴氏滅菌→改良米酒。

1.2.2 操作要點

（1）精米：選取顆粒飽滿，無霉變的糯米放入精米機精白至一定精米度，備用。

（2）糖化：選取精米后的糯米100 g 浸泡8～12 h，洗凈后蒸煮20 min，倒出后按照原料的40 %加水拌勻，復蒸20 min 后出鍋。攤晾至室溫，按原料的0.5%加入糖化發酵劑，攪拌均勻后裝入小型發酵罐中，將糯米壓實并在中心搭窩。將發酵罐放入生化培養箱中，控制環境溫度28 ℃糖化發酵48 h，備用。

（3）酵母種子液培養：酵母接種到麥芽汁液體培養基中，28 ℃下以150 r/min 在搖床培養48 h 至細胞數為1.5×108個/mL左右，備用。

（4）發酵：糖化結束后，加入一定量的純凈水，同時按照原料質量0.5 %的接種量接種酵母種子液，攪拌均勻后，放入生化培養箱中，在一定溫度下發酵3 d。

（5）后發酵：發酵結束后過濾酒液，放入冰箱在4 ℃低溫環境下繼續發酵15～30 d。

（6）過濾、澄清：后發酵結束，過濾掉殘余酒糟，得到澄清酒液。

（7）防腐、包裝、滅菌：向酒液中按0.4%的比例加入山梨酸鉀，攪拌均勻后進行罐裝與巴氏滅菌。滅菌結束后迅速冷卻至室溫，靜置，得到改良米酒成品。

1.2.3 改良米酒工藝的單因素實驗

在進行改良米酒工藝單因素實驗前確定基礎工藝條件為：精米度70 %，酒曲選擇雅大酒曲，發酵溫度28 ℃，加水量為原料的200 %。考察精米度、糖化發酵劑種類、發酵溫度、發酵加水量4 個工藝因素對米酒品質的影響。實驗中分別選用精米度為100%、90%、80%、70%、60%；安琪甜酒曲、蘇州蜂蜜曲、達州東柳植物曲、雅大酒曲等4 種糖化發酵劑；發酵溫度22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃；原料150 %、200 %、250 %、300 %、350 %的發酵加水量進行單因素發酵實驗，以葡萄糖、乙醇含量及感官品評得分為指標，確定最佳實驗參數。

1.2.4 響應面優化設計

在單因素試驗基礎上，選擇精米度（A）、發酵溫度（B）及加水量（C）3 個因素進行響應面優化試驗，以米酒感官品評得分（Y）為響應指標，確定改良米酒最佳工藝條件，因素及水平如表1所示。

表1 因素水平設計表

1.2.5 理化指標的測定與感官評分

（1）葡萄糖、酒精含量的測定：利用生物氧化酶膜電化學傳感器對待測樣品葡萄糖含量、酒精含量進行檢測。

（2）總糖的測定：酸水解后，用3，5-二硝基水楊酸測定總糖[4]。

（3）總酸的測定：參照GB/T 10345—2007 白酒分析方法。

（4）酒精度的測定：參照GB 5009.225—2016酒精計法。

（5）感官評分標準：選擇10 名食品專業人員，從米酒的色澤、香氣、口味和風格4 個指標進行評定，滿分100 分，感官評分結果取平均值，評價標準見表2。

表2 改良米酒感官評價表

1.2.6 數據處理

采用Origin2021、Excel2020、Design-Expert8.0.6等軟件對試驗數據進行處理，每個處理組進行3 次平行試驗。

2 結果與分析

2.1 改良米酒單因素實驗

精米度指“磨過之后的白米，占原本玄米（糙米）的比重”。精米的目的是盡可能保留淀粉多的心白，同時去除外層容易產生雜味的蛋白質和脂肪。因此心白保留的程度，也就是精米度，對所釀清酒的品質有很大的影響。由圖1（a）可知，乙醇含量隨著精米度的增加而顯著上升，感官得分和葡萄糖含量均在精米度為70 %時最高，乙醇含量最高時的精米度為100%，其葡萄糖含量和感官得分均為最低。沒有經過精白的原米，保留了完整的蛋白質和脂肪等，利于微生物的生長繁殖，葡萄糖利用充分，酒精發酵完全，所得產品更偏向傳統米酒，但酒液渾濁，香氣較雜，糖酸比不協調。精米度為70%時，酒體澄清透明，花果復合香舒適，酒精度適中，酸甜舒適，口感較協調。因此確定改良米酒的精米度為70%。

糖化發酵劑的作用是將糧食中的淀粉類物質經糖化、發酵等生化反應轉化成乙醇，是釀酒發酵的動力，其質量直接關系到酒的質量和產量[5]。在米酒發酵中糖化發酵劑的選擇非常重要。如圖1（b）所示，不同種類的糖化發酵劑葡萄糖含量、乙醇含量及感官品評得分相差很大。感官得分最高的東柳植物曲葡萄糖含量和乙醇含量相對均勻，所得產品香氣舒適、甜中帶酸、口感協調，還帶有淡淡的植物香氣，雅大酒曲感官次之，葡萄糖含量低、乙醇含量略高，口感略酸澀；安琪酒曲酒體較淡薄，缺少特色；蘇州蜂蜜曲具有特別的蜂蜜清香，但風格較為單一，酒香不突出。因此選定糖化發酵劑為東柳植物曲。

溫度是影響米酒發酵的重要因素，不同的發酵溫度會對酵母生長造成影響，同時影響原料活性物質的溶出、營養成分及風味物質的保留[6]。如圖1（c）所示，溫度為22 ℃時葡萄糖含量最高，乙醇含量最低，二者相差也最大，感官品評時甜味明顯，酒味很淡；24 ℃時的米酒香氣較為淡薄，米酒味不突出；在28 ℃時米酒感官得分達到最高，此時葡萄糖含量與乙醇含量較為均衡，米酒香氣突出、香味明顯、口感適中。因此選定發酵溫度為28 ℃。

米酒中水的含量高達80 %以上，所以加水量在米酒發酵中至關重要，加水量過多或過少都會影響發酵進程進而影響米酒風味。如圖1（d）所示，加水量最少時，葡萄糖含量最高，此時乙醇含量也相對較高，所得成品口味偏甜、酒體不協調；加水量最多時，葡萄糖含量最低，酒味淡薄，米酒風味不明顯；加水量在250%感官得分最高。因此選定發酵加水量為原料的250%。

圖1 不同單因素對改良米酒的影響

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面實驗結果與方差分析

通過Design-Expert8.0.6 軟件的分析，得到響應面實驗設計結果，如表3所示。

將表3 數據帶入Design-Expert8.0.6 軟件中，得到方差分析結果，如表4所示。

表3 響應面實驗設計結果

2.2.2 響應面方差及顯著性分析結果

利用Design-Expert8.0.6 軟件對數據進行多元二次擬合分析，建立感官品評（Y）和精米度（A）、發酵溫度（B）、發酵加水量（C）的回歸方程模型：Y=84.60-1.42A+0.51B-0.59C-1.15AB+1.00AC-0.18BC-4.31A2-5.14B2-4.29C2。

由表4 可知，回歸模型的P＜0.0001，說明回歸方程極顯著，能較好地模擬出真實曲面；通過F 值的大小，可知3 個因素對米酒改良工藝影響程度的大小依次為A＞C＞B；相關系數R2=0.9954，調整后的R2Adj=0.9895，二者差異＜0.2，代表該模型擬合度良好，誤差小；失擬項中F=0.35，P=0.7908，二者均大于0.01，差異不顯著，說明模擬性較好；表中P值反映了不同因素對感官評價不同程度的影響，P值越小，對感官評價影響程度越大[7-8]，在此模型中各因素對感官評價影響程度大小的次序為發酵溫度（B）＞發酵加水量（C）＞精米度（A），其中AB、AC、A2、B2、C2等項對感官品評的影響極顯著（P＜0.01），BC 等項對感官品評的影響不顯著（P＞0.05）；變異系數0.9789 %＜10 %，精密度為32.239＞4，表明該模型有較高的精密度，進一步證明該模型對米酒改良工藝的預測具有較高的可信度。

表4 響應面實驗結果的方差分析

2.2.3 響應面試驗交互作用分析

根據響應面試驗設計原理，響應面圖的曲面越陡峭，兩兩因素的交互作用就越明顯，相反，響應面圖的曲面越平緩，兩兩因素的交互作用就越不顯著。等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著[9]。

圖2 是各因素及其交互作用對改良米酒感官品評影響的響應面圖，其中：a.精米度與發酵溫度的響應曲面及等高線圖；b.精米度與發酵加水量的響應曲面及等高線圖；c.發酵溫度與發酵加水量的響應曲面及等高線圖。

根據圖2（a）可以看出，精米度一定時，感官品評得分隨著發酵溫度的增加先增后減；發酵溫度一定時，感官品評得分隨著精密度的增加先增后減；發酵溫度和精米度的交互作用顯著。發酵溫度對于改良米酒感官品評的影響相較于精米度更顯著。根據圖2（b）可以看出，精米度一定時，感官品評得分隨著發酵加水量的增加先增后減；發酵加水量一定時，感官品評得分隨著精米度的增加先增后減，發酵加水量和精米度的交互作用顯著。精米度對于改良米酒感官品評的影響較發酵加水量更顯著。根據圖2（c）可以看出，發酵溫度一定時，感官品評得分隨著發酵加水量的增加先增后減；發酵加水量一定時，感官品評得分隨著發酵溫度的增加先增后減，發酵加水量和發酵溫度的交互作用顯著。發酵溫度對于改良米酒感官品評的影響較發酵加水量更顯著。

圖2 各因素交互作用對改良米酒感官品評影響的響應面圖

2.2.4 響應面驗證試驗

根據響應面軟件分析出最佳工藝條件：精米度68.2%，發酵加水量為糯米原料的245%，發酵溫度26.2 ℃。在此工藝條件下軟件預測得分為84.8分。采用相應工藝參數，進行驗證實驗，得出的實際感官評分為89 分，與預測結果基本吻合。所得米酒總酸含量為2.23 g/L，總糖含量130.18 mg/mL，酒精含量為6.8%vol，符合T/GZSX017—2020 發酵型米酒理化要求。因此采用響應面法優化米酒工藝得到的工藝條件準確可靠，可以用于實際操作。

2.3 香氣特征及滋味感官屬性分析

對實驗制得的改良米酒與市售的同類產品進行香氣特征和滋味比較研究。結果可見圖3，其中：a.改良米酒與米色米酒（對照品）的香氣特征得分雷達圖；b.改良米酒與米色米酒（對照品）的滋味品質得分雷達圖。

品評人員主要通過米香、酒香、植物香、花果香、雜味、豐富度6 個屬性對改良米酒及其對照酒的香氣特征進行描述。圖3（a）的雷達圖為改良米酒及其對照酒的香氣特征得分情況，2 種米酒之間有顯著性差異。對照酒沒有經過精米工藝，保留有較濃郁的米香味，也保留了較多的雜味。改良米酒因為使用了東柳植物曲和異常威克漢姆酵母FBKL2.00K8 而有明顯的花果香和植物香氣，香氣豐富度大于米色米酒。

圖3 改良米酒與米色米酒香氣特征和滋味感官屬性分析雷達圖

品評人員主要通過酸、甜、苦、澀4個屬性以及綜合評價對改良米酒及其對照酒的感官特征進行描述[10]。圖3（b）的雷達圖為改良米酒及其對照酒的酸、甜、苦、澀屬性及綜合評分情況。米色米酒原料未經精米處理，所得成品保留有較強的酸味、澀味及苦味，甜味比改良米酒低，綜合評分也較低。改良米酒因前發酵周期短，所得成品含糖量高，雖有甜膩感，但甜酸比協調，苦、澀味強度較低，綜合比較之下改良米酒評分高于米色米酒。

3 結論

米酒生產中工藝條件對成品質量有很大影響。本實驗以優選貴州本土糯米為原料，采用日式清酒精米、低溫、開放式并行復發酵工藝，通過單因素和響應面實驗確定米酒最佳發酵工藝條件為精米度68.2 %，發酵加水量為糯米原料的245 %，發酵溫度26.2 ℃。在此最優發酵工藝條件下，所得米酒總酸含量為2.23 g/L，總糖含量130.18 mg/mL,酒精含量為6.8%vol，符合T/GZSX017—2020 發酵型米酒理化要求。所得酒體清亮透明，帶有淡淡的植物香與花果香，有明顯的米酒香氣，酸甜適中，風味協調。希望優化改良后的米酒工藝可以為傳統的米酒釀造生產提供新的思路。