高產乙酸乙酯畢赤酵母篩選及其耐受性能研究

李 群，林 斌，柯 鋒，樂細選，楊 強，楊生智，陳申習

（勁牌有限公司勁牌研究院中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北大冶 435100）

乙酸乙酯是清香型白酒中的主體香味成分，其含量的高低直接影響白酒風格和品質[1-2]，在清香型小曲白酒中，較高的乙酸乙酯含量可使酒的香味更加醇和濃郁。經研究發現，在清香小曲白酒實際釀造過程中，乙酸乙酯主要是通過微生物代謝底物產生的，產酯酵母在其中扮演了重要角色[3]。目前在提高清香型小曲白酒中乙酸乙酯含量方面雖取得了一定研究成果，但尚未達到理想的含量，清香型小曲白酒質量仍有很大的提升空間[4]。

據文獻報道，產酯能力較強的酵母包括畢赤酵母屬（Pichia）、漢遜酵母屬（Hansenula）、假絲酵母屬（Candida）等。近年來，對產酯酵母研究最多是球擬酵母（Torulopsis）、漢遜酵母（Hansenula）和假絲酵母（Candida）[5-6]。在清香型小曲白酒釀造中，畢赤酵母屬中一些優勢酵母種類如庫德里阿茲威畢赤酵母、發酵畢赤酵母、膜璞畢赤酵母、異常畢赤酵母等，可代謝多種酯類物質，在釀酒行業具有極大的研究價值和應用潛力。庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），對釀造環境的適應性好，對溫度、乙醇、酸度的耐受性強，可代謝產生乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯等多種酯類物質[7]。王勇[8]從牛欄山二鍋頭酒醅中篩選得到120株酵母菌，對不同酵母發酵代謝產物進行分析，發現庫德里阿茲威畢赤酵母具有較高產乙酸乙酯能力。膜璞畢赤酵母（Pichia Membranifaciens）能產生β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和一些揮發性酚類物質，如4-乙基苯酚和4-乙基愈創木酚[9-10]，可以增加原酒的香氣。姚翠萍等[11]對膜璞畢赤酵母發酵代謝產物進行分析，發現該菌主要產物為酸、醇、酯以及一些特殊呈香物質，其中，苯乙醇、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸等含量較為豐富，并能產生降低膽固醇和血脂的活性成分亞油酸乙酯。異常畢赤酵母（Pichia anomala），現名異常威克漢遜酵母（Wickerhamomyces anomalus），是白酒中普遍存在的菌種，能高產乙酸乙酯[12]，耐受低pH、低水活度、高滲透壓、厭氧等極端環境。張杰等[13]從清香型小曲白酒發酵酒醅中篩選出一種高產乙酸乙酯的異常畢赤酵母，添加該菌株釀造的清香型白酒中乙酸乙酯含量為2.86 g/L，是對照組白酒中乙酸乙酯含量的1.5 倍。發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）高產酯酶，具有較高C4—C8酯酶活性，可增加葡萄酒香味[14]。

隨著食品生物技術的發展，越來越多的功能微生物正在改變釀酒方式，通過篩選功能菌株添加到釀造中是一種有效提升白酒品質的方法。鑒于畢赤酵母在清香型小曲白酒發酵中具有較多的種類，但其不同種類及不同株在釀造中的作用尚未研究清晰，結合清香型小曲白酒品質提升需求，本文旨在通過對菌種庫不同種畢赤酵母進行產酯篩選和釀造特性研究，以期篩選出性能優良菌株，將其應用于清香型小曲白酒生產中，以期提高酒曲及其釀造質量，改善小曲白酒品質。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌種信息

所有菌株均為實驗室菌種庫保藏菌株，分離自勁牌有限公司酒曲、釀造酒醅，詳細信息如表1所示。

表1 45株畢赤酵母菌株信息

1.1.2 儀器與試劑

試劑：葡萄糖、溴甲酚紫、三丁酸甘油酯、硫酸銨、尿素、磷酸二氫銨、硫酸鎂，國藥集團化學試劑有限公司；β-淀粉酶（酶活50 000 U/g）、糖化酶（酶活100 000 U/g），無錫雪梅酶制劑科技有限公司；蛋白胨、瓊脂粉，國藥集團化學試劑有限公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術有限公司；乙醛、甲醇、正丙醇、乙酸乙酯等標準品（均為色譜純），中國醫藥集團有限公司。

儀器設備：QHZ-98A 全溫振蕩培養箱，太倉市華美生化儀器廠；5424 R 離心機，Eppendorf 公司；WFJ 2000 可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；JJ6000 電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；MJ-250BSH-Ⅱ霉菌培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；SW-CJ-1B 凈化工作臺，蘇州智凈凈化設備有限公司；YXQ-LS-75SII 高壓滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；7890A 氣相色譜儀，美國Agilent 公司。

1.1.3 培養基

YPD 液體培養基：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L，水1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。

產酯固體培養基：溴甲酚紫0.04 g/L，三丁酸甘油脂15 mL/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，121 ℃高壓滅菌20 min。

高粱汁培養基：1000 g 高粱磨粉，加入5 L 溫水，加入5 g 糖化酶、5 g α-淀粉酶，攪拌后放入60 ℃烘箱中保溫30 min，后于105 ℃，30 min 高壓蒸煮，待冷卻至60 ℃，將團塊捏碎，再加入5 g 糖化酶、5 g β-淀粉酶，放入60 ℃烘箱中糖化24 h，過濾得濾液，測定糖度，冷凍保藏備用。

酵母麩皮種培養基：麩皮1（以1計），硫酸銨5‰，葡萄糖4%，水60%，于121°C 濕熱滅菌20 min。

酵母培養基：稱取糖蜜，加入2 倍體積（按糖蜜重量計）的85 ℃熱水，攪拌至糖蜜溶解得到溶液，再加入溶液體積0.1%的濃硫酸，攪勻靜置12 h，將上層清液加至發酵罐中，并補水至糖蜜培養基的糖度為12 °Bx；按質量比為2 ‰、1 ‰、1 ‰、1 ‰、2‰、10%稱取硫酸銨、尿素、磷酸二氫銨、硫酸鎂、酵母浸粉和消泡劑并倒入發酵罐中，加水至罐容積的70 %，開啟攪拌使營養鹽完全溶解，滅菌冷卻，即得酵母培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化

從菌種庫中挑選不同種類畢赤酵母，取甘油保藏管中100 μL 菌液移入到10 mL YPD 液體管中，于30 ℃、150 r/min 搖床中培養24 h，用接種環沾取培養液在YPD 平板上進行劃線分離，30 ℃倒置培養48 h，取一環單菌落接種于YPD 液體培養基中，于30 ℃、150 r/min 搖床中培養24 h 得種子液，放冰箱冷藏備用。

1.2.2 產酯菌株初篩

取一環待測酵母菌株種子液于產酯培養基進行平板劃線，培養48 h，觀察其菌落顏色。菌株產酯能力不同呈現在產酯平板上的菌落顏色也不相同，菌落黃色越濃，表明菌株的產酯量越多[15]。

1.2.3 產酯菌株復篩

將高粱汁培養基加水調節糖度為10°Bx，分裝50 mL 至250 mL 錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。取活化后的種子液按1%（v/v）的接種量接入培養基中，裝上發酵栓，稱重，精確至0.01 g，于30 ℃靜置發酵7 d。發酵結束后取5 mL 發酵液，8000 r/min離心5 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，過濾好的發酵上清液進行氣相色譜分析。

1.2.4 酵母麩皮種制備

將待測菌株種子液按2 %（v/v）的接種量接入YPD 液體培養基中，于30 ℃搖床培養24 h。將液體種按40%（麩皮濕重計）的接種量接種于酵母麩皮培養基中，于30 ℃靜置培養48 h 后放于30 ℃烘箱烘干，通過血球計數板計數法得知所有固體種酵母數量均達到108CFU/g。將測試菌株固體種與桂花曲按照1∶19（m/m）配比成試驗混合曲。

1.2.5 酵母麩皮種擴大培養

按照1 g/100 mL 的比例稱取麥芽浸粉，用水溶解后，分裝至1000 mL 的三角瓶中，每瓶裝液量500 mL，滅菌備用；將酵母種試管純培養物接入三角瓶中，30 ℃下140 r/min 搖床培養24 h；將培養好的三角瓶接入裝有1.1.3 制備的酵母培養基的發酵罐中培養22 h，然后使用圓盤制曲機生產。將發酵罐中菌種液接種到經過滅菌的麩皮培養基中，啟動溫控系統自動控制圓盤溫度在30～32 ℃之間，培養32 h 后，出盤干燥，粉碎，檢測細胞數大于10×108CFU/g 為合格。將酵母純種制劑與公司桂花曲按照1∶19（m/m）比例配成混合曲備用。

圖像識別技術是以提取拉鉚銷位置周圍圖像的主要特征為基礎，并將待識別圖像與圖像庫的有限特征參數進行匹配，從而達到鉚接位置識別的目的。計算機圖像識別分為離線訓練和在線識別兩個步驟，每個步驟分別設計了相應的應用程序。程序核心是BP(back propagation)神經網絡算法。其中圖像特征提取及離線訓練方法直接決定了圖像識別的準確性。鉚接位置識別程序系統框圖如圖2所示。

1.2.6 固態小試試驗

糯高粱經65 ℃水浸泡24 h，浸泡好的糧食放入滅菌鍋中進行初蒸（115 ℃，10 min）、燜糧（100 ℃，5 min）、復蒸（111 ℃，10 min）。將復蒸好的糧食冷卻至30 ℃，分裝進12 號自封袋中，每袋1.05 kg，按干糧重1%的下曲量加入1.2.4 中所制備的混合酒曲，將曲與糧食攪拌均勻，放入培養箱在30 ℃下開口糖化24 h。糖化完成后，按照單個樣品500 g 的量稱取酒糟，將糖化好的糧食與酒糟按質量比為1∶1 進行混合，混勻后裝入氣體采樣袋，密封，抽真空，放入培養箱于30 ℃發酵7 d，7 d 后將發酵好的酒醅裝入特制三角燒瓶中進行蒸餾，取前100 mL酒樣進行色譜檢測。

1.2.7 中試生產試驗[5，16]

按清香型小曲白酒車間生產工藝進行中試生產。糯高粱經75℃水浸泡20 h 后，經過初蒸、燜糧和復蒸得到熟糧，攤晾后下曲（1%），分別接種對照桂花曲和1.2.5 中所制備的混合曲，將曲與糧食攪拌均勻后送至糖化箱場進行培菌糖化，糖化22 h。按照車間生產比例添加配糟，混勻后發酵周期為14 d，發酵結束后蒸餾即得小曲原酒，取100 mL 原酒進行氣相色譜檢測揮發性風味物質。

1.2.8 氣相色譜數據檢測

準確移取1 mL酒樣于2 mL樣品瓶中，加入10 μL三內標使用液（叔戊醇(IS1)：17028.1 mg/L，乙酸正 戊 酯(IS2)：16864 mg/L，2-乙 基 己 醇(IS3)：12104.2 mg/L），蓋上瓶蓋，搖勻，采用氣相色譜法測定原酒中各成分含量。色譜條件為：Agilent 7890A氣相色譜儀，檢測器FID，CP WAX 毛細管色譜柱（50 m*0.2 μm*0.25 mm）；升溫程序：柱溫40 ℃保持8 min，以5 ℃/min 升至150 ℃；進 樣口溫度250 ℃，檢測器溫度260 ℃，空氣、氫氣流速比300∶30，載氣為氮氣，分流比30∶1，柱流量1.0 mL/min；進樣方式：自動進樣。

1.2.9 菌株耐受性分析[17]

1.2.10 數據處理

使用origin 2016對實驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 產酯酵母篩選

2.1.1 產酯酵母初篩

使用產酯固體培養基對所挑選菌株（編號1—45，其中11 號菌株未成功活化）進行了產酯初篩，結果如表2 所示，外島畢赤酵母（14、15）、發酵畢赤酵母（26）、盔形畢赤酵母（40）、伯頓絲孢畢赤酵母（43）菌落為深黃色，表明產酯強；發酵畢赤（27、28）、盔形畢赤（32、39）菌落為黃色，表明產酯較強；盔型畢赤酵母（34）伯頓絲孢畢赤酵母（44）菌落為紫色，表明不產酯；其余菌株菌落為淺黃色，表明產酯較弱。

表2 產酯特性篩選結果

2.1.2 產酯酵母液態發酵復篩

對產酯初篩平板上顯示為淺黃色、黃色和深黃色菌株均進行了液態發酵復篩。如表3 所示，7 號（Y42）和6 號（Y14）具有最高乙酸乙酯含量，分別為2.81 g/L 和2.67 g/L，24 號（J32）為1.03 g/L,5 號（Y87）為1.00 g/L,4 號（Y10）為0.52 g/L。挑選該5株菌進行后續研究。

表3 不同畢赤酵母液態發酵特征

2.2 產酯畢赤酵母實驗室固態實驗

為進一步驗證復篩產酯酵母菌株對清香型小曲白酒風味影響，對液態復篩選出的5 株酵母，分別為費比恩畢赤酵母（Y10）、異常威克漢遜酵母（Y87、Y14、Y42）和庫德里阿茲威畢赤酵母（J32），進行實驗室固態釀造實驗，實驗結果如表4 所示。與對照桂花曲相比，Y10 菌株出酒率有一定提高，增加2.6 %，其他菌株無顯著差異；乙醛含量方面，除J32 外，其他菌株相對于桂花曲均有不同程度降低，其中Y87 下降幅度最大，達到54.39 %；甲醇和正丙醇含量與桂花曲相比無明顯差異；乙酸乙酯含量方面，除J32 菌株低于對照組外，其余菌株均有不同程度提高，Y10 菌株產乙酸乙酯含量提升最高，達到57.1%；雜醇油含量方面，Y10 菌株低于對照6.5 %，其他菌株與對照無明顯差異。綜合分析表明菌株Y10 在乙酸乙酯提升方面具有明顯的效果。

表4 5株畢赤酵母實驗室固態釀造結果

2.3 產酯畢赤酵母中試車間應用研究

為進一步驗證畢赤酵母Y10 在清香型白酒中試生產中的應用效果，將Y10 擴大培養制曲，按比例添加至桂花曲中進行發酵，以不添加的桂花曲為對照，每次投糧量1850 kg，連續投料9 批，發酵14 d，結果如表5 所示。與桂花曲相比，Y10 發酵出酒率相當；色譜數據方面，Y10 釀造原酒中乙醛含量提高了12.2 %，甲醇、正丙醇含量均與桂花曲無差異；乙酸乙酯方面，Y10 平均提升了13.7%；雜醇油方面，降低了2.3%。

表5 畢赤酵母Y10中試生產數據結果

2.4 產酯畢赤酵母耐受性分析

白酒發酵過程相對復雜，高溫、高糖、高酒精、高滲透壓等環境對菌株生長提出了較高的要求[18]。因此能應用于生產中的菌株需滿足一定的生理特性要求，為此對獲得的菌株開展環境耐受性研究。

以公司桂花曲中產香酵母Y29 為對照菌株，對產酯畢赤酵母Y10 進行了環境耐受性分析。結果顯示，隨著葡萄糖含量增加，酵母生物量隨之降低，Y10 和Y29 菌株最高可耐受500 g/L 的葡萄糖濃度如圖1（A）所示。由于發酵過程產生的高濃度乙醇會給酵母細胞代謝帶來毒害，使酵母停滯生長或死亡，從圖1（B）可知，隨著乙醇含量的增加，菌株生長受到抑制，Y10 和Y29 可耐受6 %的乙醇含量，隨后隨著乙醇含量增加，菌株生物量顯著下降。發酵后期酒醅中乙醇濃度不超過6 %，因此Y10酵母能夠耐受發酵過程中產生的乙醇濃度。

發酵過程中高濃度的酸類物質會降低酵母細胞的代謝速率，抑制或殺死細胞，從而影響發酵能力。如圖1(C)所示，隨著pH 值降低，酵母生物量隨之降低，但兩株菌在pH 值高于3.0 的條件下均能較好生長。酒醅發酵過程pH 值為4 左右，因此Y10酵母能夠適應酒醅的酸性環境。

溫度是影響酵母生長繁殖的關鍵因素之一，由圖1(D)可知，當溫度超過37 ℃，菌株生物量均顯著下降，在45 ℃的高溫環境下幾乎無生長，其中Y29在30 ℃有最高生物量，Y10在37 ℃有最高生物量，表明Y10菌株對高溫環境具有較好耐受性。如圖1(E)所示，Y29 和Y10 最高可耐受8%的NaCl 濃度，當NaCl 濃度超過8%時，酵母生長受到抑制，菌株生物量急劇下降。

圖1 不同條件下酵母菌株生長情況

3 結論

通過產酯顯色培養基初篩和液態發酵復篩，從公司清香型白酒菌種庫挑選的45 株不同畢赤酵母中獲得了5 株產乙酸乙酯較高的畢赤酵母。經實驗室固態發酵驗證，Y10 菌株具有最高乙酸乙酯含量，為1.21 g/L，相較于對照桂花曲提升57.1%。將Y10 擴大培養制曲應用于清香型白酒中試車間進行釀造，生產原酒中乙酸乙酯含量比對照提升了13.7%。對Y10 耐受性進行分析，該菌株能分別耐受500 g/L葡萄糖、6%乙醇、pH3.0、37 ℃和8%Na-Cl條件，滿足清香型小曲白酒的發酵條件。經文獻查閱，菌株Y10 為首次在清香型小曲白酒中開展提酯應用研究的費比恩畢赤酵母，能較好地改善原酒品質，具有較高的應用價值，進一步豐富了清香型小曲白酒功能菌資源。