鳳型大曲儲藏期不同部位理化指標及微生物群落演替規律分析

張 艷，曹 丹，孟勤燕，張永利，閆宗科

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西鳳翔 721406）

近年來，各香型白酒對大曲培曲過程中理化指標[1]、功能性酶活性[2]、風味物質產生[3]及微生物菌群結構[4-5]研究較多，但對大曲儲藏過程中各項質量指標的變化規律研究甚少。有研究表明[6-8]，大曲經過一個月的培曲發酵，形成了多菌共存的微生物環境，使曲坯中含有大量生酸菌等雜菌，因而大曲培曲結束后必須經過一段時間的儲存后熟期，待曲坯的各項生理生化指標及微生物菌群結構經過自然選擇趨于穩定后投產，避免因部分雜菌增殖造成酒醅生酸過猛，影響基酒質量及產能；儲存期間部分有益微生物會繼續增殖進而產生多種酶系，這些酶系在酒醅發酵時不僅有助于原料的利用，還能促進白酒香氣的形成。研究表明大曲儲藏期對大曲質量具有重要影響。為了從理論方面進一步提高對鳳型大曲的認識，構建以微生物群落結構為中心，輻射理化指標的理論構架，本研究在前期研究的基礎上，追蹤鳳型大曲儲藏階段理化指標及微生物菌群環境的動態變化規律，綜合分析鳳型大曲儲藏過程對白酒生產的重要價值，為后期功能微生物的篩選和鳳香型白酒生產工藝的改進提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

大曲樣品：選取鳳型大曲38#、64#兩房出房大曲進行6個月的儲存期跟蹤。

試劑：乙酸鈉、葡萄糖、斐林試劑、乙酸、可溶性淀粉等，均為分析純。

儀器設備：冷凍高速離心機DH-2000R，上海德洋意邦儀器有限公司；生化培養箱SPX-250-Ⅱ，上海龍躍儀器設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司；恒溫水浴鍋SYG-2S，常州朗越儀器制造有限公司；電陶爐。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣

分別取儲藏1～6 個月的大曲樣品進行相關指標測定（儲存4 個月的大曲樣本因疫情影響未獲得）。曲塊外圍樣品粉碎作為曲皮樣，中心樣品粉碎作為曲心樣，完整大曲粉碎作為混合樣。

1.2.2 理化指標檢測

理化指標測定參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

1.2.3 微生物群落多樣性檢測

大曲樣品送上海派森諾生物科技有限公司進行微生物多樣性檢測。

2 結果與分析

2.1 鳳型大曲儲存階段理化指標變化規律研究

2.1.1 水分變化規律

水是微生物繁殖代謝必不可少的物質，在大曲儲藏期間參與到相關功能酶系及風味物質的合成過程[9]。從圖1 可以看出，曲皮水分流失較快，整個儲藏過程中始終低于曲心，整體變化規律基本一致。與儲藏前相比，儲藏過程中部分水分流失或被微生物利用，六個月后水分含量略有降低。混合樣水分處于曲皮和曲心之間，變化規律與曲皮曲心基本相似。

圖1 大曲儲存期水分含量變化

2.1.2 淀粉含量變化規律

淀粉是微生物生長必不可少的營養物質，淀粉含量的變化可反映微生物對淀粉的利用情況，與大曲發酵儲藏過程中糖化酶和液化酶活性關系密切[10]。由圖2可知，儲藏期間由于微生物的分解利用，大曲中淀粉含量隨儲藏期的延長整體呈下降趨勢。儲存前期大曲曲皮曲心微生物生長消耗淀粉，淀粉含量逐漸降低；后期曲心微生物受水分、氧氣等影響，生長緩慢，淀粉利用率降低，含量穩定，曲皮微生物仍可消耗淀粉進行生長繁殖。

圖2 大曲儲存期淀粉含量變化

2.1.3 酸度變化規律

酸度是評價大曲質量好壞的重要指標。如圖3所示，儲藏前期大曲酸度有所降低，儲藏至三個月時由于產酸微生物（主要是乳酸菌和醋酸菌）等代謝產生有機酸使大曲的酸度升高，后期由于水分、能量物質等的消耗以及代謝產物的積累，微生物生長受到抑制，部分有機酸被微生物利用以及參與到香味物質等的合成中，大曲酸度逐漸降低后趨于穩定。整體來看，大曲曲皮酸度高于曲心，主要與曲皮微生物相對豐度較高，繁殖較快有關。

圖3 大曲儲存期酸度變化

2.1.4 糖化力變化規律

如圖4 所示，隨著儲存時間的延長，受曲皮表面水分流失、溫度變化等的影響，曲皮糖化力有所降低，儲存至3 個月時，曲皮中霉菌繁殖使糖化酶活力增強，大曲糖化力明顯升高，后期由于水分流失，營養物質消耗以及代謝產物的積累[11]，微生物生長緩慢，使曲皮糖化力逐漸降低后趨于穩定。曲心水分、溫度等受環境影響較小，糖化力變化較小，儲存3 個月時曲心內部霉菌增殖使糖化力略有升高，后期逐漸趨于穩定。整個儲藏過程中，曲皮糖化力始終高于曲心。混合樣大曲的糖化力變化規律與曲皮相似，表征曲坯在儲存期間糖化力的基本變化情況。

圖4 大曲儲存期糖化力變化

2.1.5 發酵力變化規律

大曲發酵力與酵母菌關系密切，發酵力高低直接關系到出酒率的高低[12]。由圖5可知，儲藏初期，大曲發酵力處于較低水平，隨著曲坯中酵母菌等微生物的增殖，曲皮曲心發酵力有不同程度提高；儲藏2 個月后，由于水分、氧氣以及環境等的變化，微生物生長受到抑制，曲皮曲心發酵力有所降低；后期微生物菌群動態變化使得大曲發酵力又有所升高。整個儲藏過程中，曲皮發酵力始終高于曲心，結合微生物多樣性分析，可能與鳳型大曲曲皮中乳酸菌相對豐度高于曲心有關。大曲混合樣的發酵力始終處于曲皮和曲心之間，變化趨勢同曲心基本相似。

圖5 大曲儲存期發酵力變化

2.1.6 酯化力變化規律

大曲酯化力高低受細菌影響較大，關系到大曲風味物質及其前體物質的產生[13]。從圖6 可以看出，整個儲藏過程中曲皮曲心的酯化力變化基本一致，曲心酯化力始終高于曲皮，混合樣酯化力介于曲心和曲皮之間。儲藏前期兩房大曲酯化力都較低，隨著儲藏期的延長，大曲中微生物繁殖產生大量酶系，酯化力逐漸增強，儲存至3 個月時酯化力達到較高水平，在隨后的儲藏過程中，受環境及大曲自身溫度、水分條件的影響，大曲酯化力逐漸降低后趨于穩定直至儲存期結束。這與李潔等[14]的研究結果相吻合。

2.2 鳳型大曲儲存階段微生物群落結構演替規律分析

2.2.1 真菌微生物群落結構演替規律分析

2.2.1.1 物種分類學分析

由圖7 可知，大曲儲存階段曲坯中真菌群落歸屬于4 個菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycita）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉菌門（Mortierellomycota）。儲存期大曲曲皮中Ascomycota 占絕對優勢，相對豐度在85 %以上，Mucoromycita 占比在9.68%以上，Basidiomycota、Mortierellomycota 占比極小；曲心中Ascomycota 占比達99.9%以上；混合樣中Ascomycota 占比在98 %以上，含有少量的Mucoromycita，占比在1%左右。

圖7 儲存期大曲門水平真菌群落結構分布

大曲中微生物種類繁多，不同菌群間相互作用不僅促進了大曲的成熟，而且產生眾多酶系為白酒發酵提供動力[15]。從圖8 可以看出，儲藏期曲坯中真菌屬種類較少，曲皮曲心種群豐富度差異較大，但均以Thermoascus（嗜熱子囊菌）為主，大曲在發酵過程中經過大火期，高溫條件使大部分微生物死亡，耐高溫的Thermoascus得以存活。大曲儲藏1個月時曲皮中優勢菌群除Thermoascus外，還有一定量的Aspergillus（曲霉菌屬）、Pichia（畢赤酵母屬）以及Rhizopus（根霉菌屬），后隨著儲存期的延長，曲皮中優勢菌群Thermoascus占比略有降低，直至儲存六個月時又有所升高；Aspergillus相對豐度在儲存兩個月時迅速降低直至儲藏期結束，占比均在1 %以下；Pichia和Rhizopus占比在整個儲藏過程中變化不大。由于曲心內部受水分、溫度變化影響較小，微生物數量變化不明顯，曲心菌群中Thermoascus和Aspergillus占絕對優勢，整個儲存過程中相對豐度達99 % 以上；混合樣中Thermoascus始終占主導地位，儲存期相對豐度在46.96 %～60.90%之間，呈先增大后降低的趨勢，在儲存的第三個月相對豐度最大，Aspergillus和Pichia也占有一定比例，隨著儲存時間的延長，Aspergillus與Thermoascus相對豐度呈現此消彼長的變化趨勢，Pichia在整個發酵期相對豐度為8.11 %～14.34 %。大曲中優勢微生物對白酒釀造至關重要，不同大曲中優勢菌屬不同形成了不同香型的白酒[16-17]。

圖8 儲存期大曲屬水平top10真菌組成柱狀圖

2.2.1.2 Alpha多樣性分析通過Illumina高通量測序對鳳型大曲儲存階段曲坯不同部位真菌群落進行多樣性分析，在97 %相似度水平下對序列聚類并進行OTU 劃分，結果見表1。

表1 大曲儲存階段不同部位真菌Alpha 多樣性指數

Alpha 多樣性是對單個樣本內微生物群落進行多樣性和豐富度分析。表1 中coverage 數值在0.999957～0.999994 之間，表明本次測序結果能完整反映儲存期大曲中真菌菌群組成的真實情況。由表1 可知，大曲儲存階段曲皮、曲心及混合樣品中真菌群落豐富度隨儲存時間的變化呈現不同的變化規律，多樣性受儲存時間影響較小。整體來看曲皮中真菌群落多樣性和豐富度明顯高于曲心，混合樣品居于曲皮和曲心之間，接近曲皮。大曲儲存期是曲坯后熟階段，出房新曲中含有的真菌在儲存階段經過自然生長消亡逐漸達到平穩狀態，大曲的生化性能等也逐漸趨于穩定，為后期酒醅發酵提供動力基礎[18]。

2.2.1.3 層次聚類分析

圖9 是儲存期大曲真菌群落層次聚類樹及對應的屬水平top10 物種豐度，根據0.2 聚類距離劃分，圖中所有樣本被分為三大類，儲存2 個月、3 個月、5 個月、6 個月的曲皮樣本被分為一類，曲心樣本被分為一類，混合樣本、儲存一個月的曲皮樣本被分為一類，三大類下又被分為不同小類。整體而言，除QC1P 樣本外，曲皮、曲心、混合樣本分別被劃分為不同類，說明儲存期大曲曲皮、曲心、混合樣中真菌群落組成及相對豐度存在明顯差異。對比物種豐度圖來看，混合樣本中真菌組成主要包括Thermoascus、Aspergillus、Pichia、Rhizopus，曲心樣本中真菌組成主要包括Thermoascus、Aspergillus，曲皮樣本中真菌組成主要包括Thermoascus、Pichia、Rhizopus，不同類別下真菌菌群物種組成及相對豐度各不相同。

圖9 儲存期大曲樣本中真菌聚類樹圖

2.2.2 細菌微生物群落結構演替規律分析

2.2.2.1 物種分類學分析

鳳型大曲儲存階段門水平下共檢出25 種細菌門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）等。由圖10可知，儲存期大曲曲皮、曲心、混合樣品中Firmicutes 為優勢菌門，但相對豐度有所差異，曲皮占比56.83%～76.64%，曲心占比15.73%～30.13%，混合樣占比63.89 %～71.99 %；Actinobacteria 和Proteobacteria 也占有一定比例，二者在曲皮和混合樣中的相對豐度明顯高于曲心，這主要是因為大曲培曲后期曲皮環境利于細菌生長，故相對豐度較高，曲心因高溫缺氧抑制了細菌的生長，相對豐度較低。

圖10 儲存期大曲門水平細菌群落結構分布

圖11 儲存期大曲屬水平top10細菌組成柱狀圖

大曲儲存期間細菌物種組成豐富，曲皮曲心細菌種類及占比差異較大。在整個儲藏過程中，曲皮細菌主要以Lactobacillus（乳桿菌屬）、Weissella（魏斯氏菌屬）、Streptomyces（鏈霉菌屬）為主，Lactobacillus在儲藏3 個月時相對豐度增大至39.27 %，后期又降低至30 %左右，Weissella占比在20.88 %～26.48%；儲藏前期曲皮中Staphylococcus（葡萄球菌屬）占比極小，只有0.29 %，在儲藏的第2 個月，對環境有所適應的微生物再次生長繁殖，Staphylococcus占比迅速增大至3.85%，直至儲藏期結束相對豐度變化不大；Streptomyces在儲藏的前期和后期相對豐度占比較大，但儲藏2～3 個月時由于Lactobacillus、Acetobacter（醋桿菌屬）等細菌的增殖，Streptomyces占比有所降低；曲皮中Brevibacterium（短桿菌屬）和Corynebacterium（棒狀桿菌屬）在儲藏中期相對豐度明顯增大，后期隨著曲皮水分流失及微生物衰亡，相對豐度降低。曲心細菌主要以Lactobacillus和Weissella為主，隨著儲藏期延長，二者相對豐度呈現先增大后減小的趨勢，這可能是大曲培曲階段曲心內部細菌受條件限制繁殖情況較曲皮弱，營養物質消耗少，儲存階段曲心細菌會小幅度增殖，至儲存6 個月時隨著營養物質消耗、產物積累等生長環境變化抑制了其進一步生長繁殖，相對豐度降低；儲藏前期Staphylococcus占比達到48 %，但從第2 個月開始占比迅速降低至2 %，直至儲藏期結束占比一直較低，這可能是因為Staphylococcus生長對氧氣、水分等的需求較大，其他微生物的生長對氧氣等的消耗抑制了它的生長。儲存5 個月的混合樣中Staphylococcus和Corynebacterium占比較大，區別于其他月份。混合樣中細菌主要以Lactobacillus、Weissella和Streptomyces為主，占比60.54%～72.48%。大曲儲藏過程中細菌群落結構在自然環境下不斷調整，形成最佳的微生態環境，為后期釀造發酵提供動力基礎[19]。

2.2.2.2 Alpha多樣性分析

通過Illumina高通量測序對儲存期大曲樣本進行細菌多樣性分析，在97 %相似度水平下對序列聚類并進行OTU劃分，結果見表2。

表2 儲存大曲細菌Alpha多樣性指數

對儲存期大曲中不同部位的細菌菌群進行Alpha 多樣性分析，結果見表2。表中coverage 數值在0.97958～0.99478 之間，表明本次測序結果能完整反映儲存期大曲中細菌菌群組成的真實情況。Chao1 和Observed_species 指數反映了大曲中細菌的豐富度，從表2 可以看出，儲存期大曲曲皮中細菌豐富度高于曲心和混合樣，且隨著儲存時間的延長，曲皮、曲心、混合樣中細菌豐富度均呈現先增大后降低的趨勢，這與儲存期大曲中真菌豐富度的變化規律相同，表明大曲儲存期間仍有部分真菌和細菌繼續增殖，通過自身不斷的代謝調整逐漸形成穩定的微生物群落結構[20]。儲存一個月的曲皮曲心中細菌多樣性較低，第2 個月開始隨著微生物增殖，細菌多樣性有所增大。

2.2.2.3 層次聚類分析

對儲存期大曲中細菌群落基于Weighted Unifrac 距離算法進行層次聚類分析，可直觀反映各樣本之間的相似性。根據0.25 聚類距離劃分，圖12中所有樣本被分為兩大類，每一類下又被分為多個小類，同一分支的樣本表明其相似性高。整體來看，曲心樣本中細菌群落結構組成和曲皮樣本差異較大，混合樣本的相似性和曲皮較為相似，對應屬水平top10 物種豐度圖可知，這種差異主要源于大曲不同部位細菌組成的多樣性和豐富度。

圖12 儲存期大曲樣本中細菌聚類樹圖

3 結論

本試驗對鳳型大曲儲存后熟期的理化指標和微生物菌群演替規律進行了研究，結果表明：鳳型大曲儲藏期微生物會小范圍增殖，大曲水分下降5%左右，曲心始終高于曲皮；微生物對淀粉的利用率在2%～7%之間；儲存期大曲中酸、醇等物質相互作用，使曲坯酸度在儲存結束后有所降低；儲存期大曲糖化力、發酵力曲皮高于曲心，酯化力曲心較曲皮高，儲藏2～3 個月時隨著微生物的變化，糖化力、發酵力、酯化力較高，后期逐漸趨于穩定。儲存期大曲曲皮和曲心中真菌群落結構組成不同，曲皮以Thermoascus、Pichia、Rhizopus為主，相對豐度占比52 %～84 %，曲心以Thermoascus、Aspergillus為主，占比99 %以上。對比培曲階段曲坯真菌群落結構來看[21]，儲存階段曲皮真菌結構組成變化較大，由出房曲的以Thermoascus、Issatchenkia為主演變為以Thermoascus、Pichia、Rhizopus為主，曲心微生物優勢菌屬始終為Thermoascus和Aspergillus。儲存期大曲中曲皮曲心細菌組成種類相似，均以Lactobacillus、Weissella、Streptomyces為主，但相對豐度占比差異較大，曲皮在77%～88%之間，曲心在20 %～55 %之間。Alpha 多樣性結果進一步表明儲存期大曲曲皮微生物多樣性較曲心高。聚類分析結果表明鳳型大曲曲皮、曲心中微生物多樣性和豐富度存在明顯差異。