液液微萃取結合GC-MS-SIM法檢測醬香型白酒中15種微量成分含量

陸倫維，孫優蘭，王金龍，韋露露，尹延順，程平言，胡 峰

（貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州習水 564622）

醬香型白酒是以高粱為主要原料，以高溫大曲作為糖化發酵劑，采用固態發酵方式，經蒸煮、糊化、糖化、蒸餾、儲存和勾調等步驟而形成的蒸餾酒，其工藝復雜性在中國白酒行業內具有唯一性[1]。在蒸餾、勾調及貯存體系中，為白酒帶來了豐富的微量成分。這些成分或構成白酒骨架香氣，或賦予白酒獨特風格和口感，或賦予白酒多種功效作用[2-4]。

近年來，許多學者對醬香型白酒與人體健康的關系進行了深入研究，特別是吡嗪類和酚類化合物[5]。白酒中的吡嗪類化合物是由美拉德反應和芽孢桿菌代謝產生。吡嗪是1,4 位含氮的六元雜環化合物，其衍生物廣泛存在于天然和發酵食品中，具有類似于炒堅果、烤肉的怡人香氣[6]，由于它們具有極低的風味閾值，還對其他香味物質有明顯的烘托作用，可使白酒的香氣更為豐滿，對白酒風味有重要貢獻[7-8]。另外，吡嗪還略帶廣藿香、香草根及薄荷香味，用于制作香水，具有強烈、自然、持久的效果[9]。

吡嗪類物質作為白酒中一類重要的健康功能因子，很多專家學者對其進行了研究。李大和等[10]闡述了白酒中的功能性成分對人體生理功能有一定影響；孫寶國等[11]對白酒中有益成分及其功效進行了系統綜述，其中的有益成分主要包括低分子有機酸、內酯類、酚類、雜環類、氨基酸和微量元素等；徐巖等[12]對醬香型、濃香型和董香型白酒中的生物活性成分進行了系統研究，主要包括萜烯類、吡嗪類以及多酚類化合物；羅強等[13-14]證明了醬香型高溫大曲白酒中吡嗪類物質具有體外抗炎活性和對幽門螺桿菌代謝物誘導人胃上皮細胞炎癥的抑制作用。除此之外，一些含吡嗪的天然產物對人類的醛糖還原酶(ALR2)有抑制活性，有助于減輕糖尿病并發癥[15]。研究表明，吡嗪類化合物具有擴張血管、促進血循環、改善學習障礙、護肝等功能[12]，近年來成為白酒健康養生領域的一個研究熱點。

酚類亦稱為多酚，是芳香烴環上氫被羥基取代的一類芳香族化合物[16]，廣泛存在于釀酒原料中，如葡萄、大麥等各種釀酒谷物[17-20]。酚類物質是由釀酒原料中的單寧、木質素、蛋白質等物質分解而來，或經由發酵過程中微生物直接代謝生成，或是由釀造過程中形成的氨基酸和阿魏酸等中間產物經酵母菌或細菌代謝生成[21]。揮發性酚類化合物是白酒中的重要香味組成部分，對于白酒的聞香、口味及穩定性等方面均具有重要的作用。揮發性酚類化合物在白酒中的含量極少，但呈香作用卻很強，在幾百萬分之一甚至千萬分之一就能使人感覺到強烈的香氣[22]。酚類物質為白酒提供了獨特的煙熏風味、焦醬味、奶香味和窖泥味等，是白酒主要的風味組成[23-27]。

酚類化合物不僅是白酒中重要的風味物質，更是一類具有生理活性的功能成分。4-甲基愈創木酚和4-乙基愈創木酚不僅是良好的抗氧化成分，還可以預防疾病、延緩衰老、增強機體免疫力、抗腫瘤、降低血糖活性[28-31]；苯酚作為阿司匹林及磺胺藥等醫藥的原料，也具有一定的醫用價值；愈創木酚可用于慢性支氣管炎多痰咳嗽的治療；麝香草酚具有抗菌活性、祛痰治咳等作用[32]；異丁香酚具有抗氧化、防腐功效[33]。

液液微萃取最大的優點是萃取時間短，且該方法集采樣、萃取和濃縮于一體，具有快速、成本低、富集效率高、有機溶劑用量少的優點[34-35]。本研究建立了液液微萃取結合GC-MS-SIM 法快速檢測醬香型白酒中15 種吡嗪和酚類化合物的檢測方法，并對12 個醬香型白酒中吡嗪和酚類化合物的含量分布進行了統計分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：見表1，均購于市場。

表1 21個醬香酒樣信息

試劑：無水乙醇（色譜純），默克公司；乙醚（色譜純，純度≥99.5%），重慶川東化工有限公司；正己烷（色譜純，純度≥99.5%），安徽天地高純溶劑有限公司；氯化鈉（分析純，純度≥99.5%），成都金山化學試劑有限公司；標準樣品2-甲基吡嗪（≥98.0%）、2,5-二甲基吡嗪（≥98.0%）、2,6-二甲基吡嗪（≥98.0 %）、2-乙基吡嗪（≥99.0 %）、2,3-二甲基吡嗪（≥95.0%）、2,3,5-三甲基吡嗪（≥98.0%）、2,3-二乙基吡嗪（≥98.0 %）、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪（≥98.0%）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（≥98.0%）、愈創木酚（≥98.0%）、4-甲基愈創木酚（≥98.0%）、4-乙基愈創木酚（≥97.0%）、苯酚（≥98.0%）、4-甲基苯酚（≥99.0%）、4-乙基苯酚（≥97.0%），ANPEL公司。

儀器設備：7890A-5975C 氣相色譜質譜聯用儀，美國安捷倫科技有限公司；MPS2多功能自動進樣系統，德國Gerstel 公司；電子天平AR2130/C，上海奧豪斯公司；QT-1 旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準樣品配制

稱取不同質量的各標準樣品于100 mL 容量瓶中，加入53%vol 乙醇水溶液進行溶解并定容至刻度線，得到混合標樣母液。取混合標樣母液1 mL于50 mL 容量瓶中，加入乙醇水溶液稀釋定容，得到稀釋的混標溶液；將混標溶液分別稀釋1 倍、2倍、4 倍、8 倍、16 倍、32 倍、64 倍作為梯度標準溶液備用。

1.2.2 樣品前處理

取2 mL 酒樣于25 mL 具塞試管中，用飽和氯化鈉溶液將其稀釋至10%vol左右，旋渦混勻，加入2 mL 萃取劑（乙醚∶正己烷=1∶1）進行萃取，渦旋振蕩混勻1 min，靜置分層5 min，取上清液于樣品瓶中上機分析。

1.2.3 GC-MS分析檢測

色譜分析條件：安捷倫DB-FFAP 毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速1.2 mL/min，不分流模式，進樣量2 μL；升溫程序：起始40 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升溫至80 ℃，不保持，以2.5 ℃/min 升溫至115 ℃，不保持，以8 ℃/min 升溫至155 ℃，不保持，再以5 ℃/min升溫至220 ℃。

質譜分析條件：傳輸線溫度250 ℃；EI 離子源；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；四級桿溫度150 ℃。溶劑延遲7 min；定性采用全掃描模式，掃描范圍30.00～350.00 amu。

1.2.4 定量分析

定量采用SIM 模式，SIM 參數見表2。以待定量物質峰面積（y）為縱坐標，待定量物質質量濃度（x）為橫坐標建立標準曲線，線性相關系數進行評估。

表2 選擇離子檢測模式參數

1.2.5 數據處理

數據統計分析及表格制作采用軟件Microsoft Excel。

2 結果與分析

2.1 總離子流圖及標準品質譜圖

利用標準樣品，根據上述質譜條件，所得總離子色譜圖及標準樣品質譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 15種標準樣品總離子流色譜圖

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

將7 個梯度的標準樣品混合液進行GC-MS 分析，以質量濃度-峰面積進行線性回歸，繪制標準曲線，15 種標準樣品在各自的線性范圍內R2均大于0.9990，線性關系良好。通過添加標準樣品和重復進樣計算樣品加標回收率和儀器精確性，結果見表3。結果表明，15 種標準樣品的相對標準偏差均低于5.00 %，加標回收率在84.23 %～98.85 %之間，表明該方法對于檢測這15 種標準樣品具有很好的準確性和精確性，完全能夠滿足分析要求。

表3 15種標準樣品的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限及定量限

2.3 樣品檢測結果

按照試驗方法分析定量12 個醬香型白酒中9種吡嗪和6 種多酚含量，結果如表4 和表5 所示，典型的總離子流圖見圖2。

表4 酒樣中9種吡嗪定量結果

表5 酒樣中6種多酚定量結果

圖2 典型樣品總離子

四甲基吡嗪又稱川芎嗪，可通過微生物代謝和美拉德反應產生，對酒體貢獻甜香、水果香及花香，具有抑制血小板聚集、改善微循環及降低腦萎縮傷害等生理功效。四甲基吡嗪在吡嗪類物質中含量最高，12 個醬香型白酒中均有檢出，但不同樣品中含量差異較為顯著，總體上看，省外酒樣含量相對較低。其中，JX-8 酒樣中四甲基吡嗪含量最高，達8.10 mg/L；JX-5 和JX-9 樣品中四甲基吡嗪含量均高于3 mg/L，相對較高；其余酒樣均低于1 mg/L，相對較低。2,3-二乙基吡嗪由于含量較低，在所有酒樣中均未檢測到，其他吡嗪類物質均在酒樣中檢測到。除四甲基吡嗪外，其他含量較高的吡嗪類物質有2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪和2-甲基吡嗪，2,3-二甲基吡嗪和2-乙基吡嗪含量相對較低。從吡嗪類總含量來看，12個醬香型白酒中吡嗪類物質含量范圍為1.00～11.89 mg/L，JX-8酒樣最高，JX-2酒樣最低，差異較為顯著。

酚類物質是由高粱、小麥、大曲等釀酒原料中的單寧、木質素、蛋白質等物質分解而來，或經由發酵過程中微生物直接代謝生成，或是由釀造過程中形成的氨基酸和阿魏酸等中間產物經酵母菌或細菌代謝生成。4-甲基愈創木酚和4-乙基愈創木酚是優良的自由基清除劑，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、提高免疫力、阻斷致癌物形成等功能。在12個醬香型酒樣中均檢測到6 種酚類物質，但總含量相對較低，苯酚在酚類物質中含量最高，4-甲基愈創木酚和4-乙基愈創木酚含量相對較低。從酚類物質總含量來看，其含量范圍為0.32～0.84 mg/L，JX-4 酒樣最低，JX-12 酒樣最高，酚類物質總含量在所有酒樣中差異相對較小?？傊?，由于釀酒原料、操作工藝和微生物環境等差異，導致了不同廠家或地區的酒樣中吡嗪類物質和酚類物質的含量差異，進而影響了酒體風格特征和質量。

3 結論

GC-MS-SIM 方法具有檢測快速、準確性高、專一性強等優點，應用該方法結合液液微萃取對12 個醬香型白酒中的15 種微量成分進行了定量分析。結果表明，在醬香型白酒中，四甲基吡嗪是含量最高的吡嗪類物質，2，6-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪含量也相對較高，2,3-二乙基吡嗪因含量較低未在上述酒樣中檢出，不同酒樣中吡嗪類物質含量差異較大。酚類物質中苯酚含量相對較高，4-甲基愈創木酚和4-乙基愈創木酚含量相對較低，整體而言，酚類總含量均較低，但因為其閾值相對較低，對酒體風味仍然有較大貢獻。上述研究結果可為白酒微量成分研究提供借鑒和參考，白酒中微量成分還有很多值得研究之處，特別是其產生機制、作用機制、拮抗機制及白酒與健康研究等，這是中國白酒研究人員現階段甚至未來幾十年的研究重點領域之一，也是中國白酒進軍世界的關鍵研究點。