甘薯無糖組織培養技術的應用

解曉紅，解紅娥，王凌云，王萌，吳宇浩，張鴻興，李江輝

（山西農業大學 棉花研究所，山西 運城 044000）

甘薯用途多樣，營養豐富，被世界衛生組織列為13種最佳蔬菜之首，是現代人追求的功能食品[1-3]。近幾年來，甘薯種植面積穩中有升，但由于種植區域引種混亂、長期連作、病蟲害綜合防治盲目，使得病毒病發生日趨嚴重，造成減產50%～80%，甚至絕收，甘薯病毒病已成為甘薯產業化發展的制約因素[4-6]。甘薯脫毒健康種苗快繁技術體系的建立[7-9]，很好地解決了病毒病困擾問題，但脫毒組培苗在傳統微繁殖中，以蔗糖作為組培苗生長碳源進行異養生長，導致脫毒組培苗的光合能力弱，生長質量差[10-11]，組培苗經多次繼代快繁后，出現黃、枯葉，莖尖生長萎靡、死亡，而后又呈二次多頭生長；加之傳統組培微生物污染嚴重，生根質量差，移栽馴化死苗現象嚴重，移栽成活率低，難以滿足生產中優質脫毒健康種苗產業化應用。

無糖培養技術是環境控制技術與組織培養技術的有機結合，是用CO2代替糖作為碳源使組培苗進行自養生長，通過動態調整CO2濃度，人工控制光、溫度、濕度，優化生長環境，提高脫毒組培苗的自身光合能力和適應外界環境能力，減少微生物污染率，從而促進植株健壯生長[12-16]。同時無糖培養的組培苗可一次性過渡成苗，提高了培養效率及移栽成活率，縮短了馴化緩苗時間，有效降低組培苗的生產成本[17]。目前國內外學者在微環境控制、CO2影響及裝置、成本分析等方面進行了諸多的研究，研究結果已在花卉、中草藥、馬鈴薯、草莓、花椰菜等多種植物中得到成功應用[18]。

本研究探討無糖培養條件下不同基質及濕度對甘薯組培苗生長狀況的影響，旨在為提高甘薯組培苗生長質量、改良甘薯種苗（薯）健康繁育提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

晉甘薯9號、晉甘薯3號組培苗由山西農業大學棉花研究所甘薯室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同基質處理對無糖培養組培苗影響 將試驗基質砂子、蛭石裝到無糖培養盒中，加入適量的營養液（硝酸銨鈣2.0 g/L+KH2PO4170 mg/L），使基質手握成團，指縫不滴水，把剪切成2～3 cm莖段的甘薯組培苗移入培養盒中。為簡化程序、節約成本，2種基質均不作滅菌處理，定期噴灑營養液確保盒內濕度在85%以上，每個處理30盒，每盒移植90苗。15 d調查組培苗的移栽成活率、細菌感染率、長勢和生根數等。每處理每次隨機選取5盒調查，重復3次。

1.2.2 基質濕度處理對無糖培養組培苗影響 以蛭石作為基質，加入營養液（2 g/L硝酸銨鈣+170 mg/L KH2PO4）。試驗設6個處理，即蛭石∶營養液（g∶mL）A. 660∶880；B. 660∶850；C. 640∶880；D. 640∶850；E. 670∶820；F. 670∶800。每盒移植90苗，用封口膜封閉培養盒。每個處理30盒。15 d調查組培苗的爛根率和長勢，以組培苗85%生根為標準統計生根時間，每處理每次隨機選取5盒調查，重復3次。

1.2.3 無糖培養與傳統培養對比研究 傳統培養：將已接種45～55 d的甘薯組培苗剪切成2～3 cm莖段接種在無激素添加的MS培養基上，于光強約1 600 μmol/（m2·s）、光周期12 h/d、溫度（28±1）℃條件下進行快繁培養，接種450瓶（每瓶6株，共2 700株）。

無糖培養：將已接種45～55 d的甘薯組培苗剪切成2～3 cm莖段移植到裝有蛭石的無糖培養裝置中進行微繁殖和生根培養。移栽后放入密閉房間培養架上，前2 d不進行光照；自第3天始開2盞燈，約80 μmol/（m2·s），第8天始開4盞燈，約160 μmol/（m2·s），光 照12 h/d，溫 度（28±1）℃。0～5 d脫毒苗處于緩苗期，光合作用較弱，不進行CO2供氣；避免培養盒中濕度下降過快，植株發生萎蔫[17]。第5天開始供CO2200～600 mL/min，第10天開始供CO22 000 mL/min。CO2工作時間同光照時間一致，12 h/d。移植30盒（每盒90株，共2 700株）。

30 d后，每處理每次隨機選取450株（5盒無糖培養、75瓶傳統組培），調查傳統組培和無糖培養的污染率，重復3次；同時每重復隨機選取20個植株調查株高、根數、根長、單株鮮質量和株干質量等。

1.2.4 組培苗網棚移栽 傳統組培苗移栽參照“甘薯脫毒苗圃地直接移栽技術研究”[19]。

無糖培養組培苗外移。無糖培養25 d后，打開上盒蓋，在自然條件下進行煉苗過渡，第3天視基質干濕程度適當噴水，4～5 d外移溫室。從無糖培養盒中直接拿出組培苗，移栽到溫室土壤中，溫室土壤濕度13%～14%，環境濕度75%以上。

分3次移栽，傳統組培和無糖培養每次各移栽900株，7 d調查不同培養方式甘薯組培苗移栽的成活率。

1.3 數據分析

試驗數據采用SPSS 27.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 無糖培養中不同基質對培養效果的影響

結果表明，以透氣性好、保水性能佳、污染源少的蛭石為作基質，晉甘薯3號和晉甘薯9號組培苗細菌（霉菌）感染率分別為1.18%和0.96%，成活率99%以上，組培苗葉綠、生長健壯。以砂子作基質，晉甘薯3號和晉甘薯9號的細菌（霉菌）感染率分別為12.74%和10.59%，成活率分別為79.26%和93.04%（表1），可見，以蛭石作為基質無糖培養效果明顯優于砂子。此外，同種基質培養下，晉甘薯9號的各指標均優于晉甘薯3號。

表1 基質對無糖培養效果的影響（15 d）Tab.1 Effects of substrate on sugar free culture（15 d）

2.2 蛭石濕度對組培苗生長的影響

基質濕度是影響通氣性、微生物活動重要因素之一，對組培苗生長、誘發新根和成活起關鍵作用[19]。以蛭石為培養基質，硝酸銨鈣2.0 g/L+KH2PO4170 mg /L作營養液，研究濕度對試管苗生長和移栽成活率的影響，結果表明，晉甘薯3號和晉甘薯9號均表現為F處理組培苗生長及生根最好，其爛根率分別為6.21%和0.59%，生根天數約為8 d，原因可能是由于濕度比較小維持了基質的通透性，便于組培苗根系的營養吸收和呼吸。A、B、C、D處理由于濕度大，影響了通氣性，使組培苗根系呼吸、生長受阻，造成組培苗感染病菌腐爛死亡（表2）。

表2 蛭石濕度對試管苗生長的影響Tab.2 Effect of vermiculite humidity on the growth of test tube seedlings

2.3 傳統組培和無糖培養對組培苗生長的影響

分別將2個處理的組培苗取出，洗凈基部培養基及基質，測定株高、根數、根長、鮮質量、干質量，結果如表3所示，晉甘薯3號、晉甘薯9號無糖培養的株高較傳統組培分別高0.477、0.882 cm，差異顯著（P＜0.05）；生根數分別增加2.04、2.32條/株，差異顯著（P＜0.05）；根長差異不顯著。單株鮮質量分別平均增加2 613.9、2 654.7 mg，差異顯著（P＜0.05）；單株干質量分別平均增加265.3、258 mg，差異達顯著水平（P＜0.05）；無糖培養污染率分別為1.18%、0.96%，傳統組培污染率分別為15.11%、10.22%，差異極顯著（P＜0.01）。無糖培養條件下，甘薯組培苗通過光合自養合成自身所需的有機物，生長速度快，生長健壯。培養30 d統計組培苗生長情況，無糖培養植株葉片增大，較直立，葉色濃綠，組培苗健壯；傳統組培植株葉片細小，有黃葉、枯葉（圖1）。

表3 不同培養方式對甘薯組培苗生長的影響（30 d）Tab.3 Effects of different culture modes on growth of sweet potato tissue culture seedlings（30 d）

圖1 不同培養方式甘薯組培苗生長對比Fig.1 Comparison of sweet potato tissue culture seedlings under different culture modes

2.4 傳統組培和無糖培養對組培苗移栽成活率的影響

溫室移栽7 d調查統計結果顯示，無糖培養的晉甘薯3號和晉甘薯9號移栽成活率分別為97.74%和98.30%；傳統組培二者移栽成活率分別為90.04%和91.15%，差異顯著（P＜0.05）（表4），可見，無糖培養移栽的組培苗較傳統組培的組培苗緩苗時間短，成活率高?？赡苁且驗闊o糖培養過程中自身合成的光合產物促進了組培苗根系快速生長，生根數量增加，根系粗壯，有韌性；傳統組培的組培苗從恒溫恒濕的異養環境移栽到網棚后，有些組培苗不能適應自養環境而死亡。

表4 不同培養方式甘薯組培苗移栽成活率的影響（7 d）Tab.4 Effect of different culture modes on transplanting survival rate of sweet potato tissue culture seedlings（7 d）

3 結論與討論

無糖培養技術是環境控制技術和組織培養技術的結合，很好地解決了傳統有糖培養中微生物污染嚴重、植株生理代謝異常、生長細弱、馴化階段植株死亡率高等問題。甘薯無糖培養需要強制通入CO2，增加光照強度，促進組培苗進行光合作用生產有機物來維持和促進生長，所以進行無糖培養的組培苗必須具有一定葉面積的外植體[14]。本試驗中，采用已接種45～55 d組培苗剪切成2～3 cm莖段，帶有2～4個葉片，組培苗能充分進行光合作用，生產的有機物促使組培苗生長加快，葉片增大，葉色濃綠，根系發達，苗木健壯。此外，甘薯無糖培養需要一定基質作為支撐物，基質的通氣性和濕度是微生物活動的重要因素之一，對組培苗生長、誘發新根和成活起關鍵作用。選擇透氣性好、保水性能佳、污染源少的的蛭石作為支撐物，維持了基質的通透性，可促進組培苗根系營養吸收和呼吸，組培苗生長健壯，可以不經過馴化階段直接移栽，縮短了培養周期。另外，試驗選擇硝酸銨鈣2 g/L+磷酸二氫鉀170 mg/L代替MS作為營養液澆灌，滿足了組培苗生長所需營養，簡化了程序，節約了生產成本。

作為一種新的培養方法，無糖培養技術已經成功在部分植物中得到廣泛應用。屈云慧等[16]研究表明，情人草組培苗在不同基質中無糖培養較傳統組培根數增加7～9條，根長增加0.40～1.05 cm，生根率提高10.0%～18.3%。淡明等[20]研究認為，甘蔗無糖培養株高較常規培養高1.03 cm，差異不顯著，無糖培養的植株鮮質量比常規培養的多0.73 g，生根數和根長分別為3.60條/株和1.08 cm，與常規培養差異顯著。肖玉蘭等[21]以非洲菊試管苗為試材，用MS無糖培養基培養，采用2孔透氣封口膜，濾膜微孔直徑0.5 μm，在光照8 000 lx+CO23 920 mg/m3條件下，植株生根快，健壯，葉片大，干物質含量高。張婕等[22]對黃菖蒲無糖培養研究認為，無糖培養組培苗株高、葉長、葉數、根長和根數等生長指標高于傳統組培方式，且增加濃度能大大加快植株生長速度。我們在甘薯上的研究進一步支持了這些結果。隨著植物無糖培養技術理論體系的日臻成熟，這一技術將以低成本生產高質量微扦插種苗的優勢，應用于植物工廠化、規?；a中。

本研究獲得了無糖培養的適宜基質為蛭石，最佳濕度為蛭石∶營養液（g∶mL）=670∶800，與傳統組培比較顯著提高了甘薯組培苗生長質量和移栽成活率。研究僅從無糖培養的基質及其濕度對甘薯組培苗生長質量方面進行了初步的探討研究，對于甘薯無糖培養組培苗最適宜光合速率的最佳CO2濃度、最佳光照強度等問題還需進一步深入探討。