基于psbA-trnH序列的秦艽分子鑒定及其藥效分析

姜釗，張景瑜，張衛花，孔秀梅，姜一，冀旭，趙勤

（1.西藏民族大學 西藏藏醫藥研究中心藏藥活性成分及藥理機制研究聯合實驗室，陜西 咸陽 712082；2.西藏民族大學 藥材檢測技術教育部工程研究中心，陜西 咸陽 712082；3.西藏民族大學 高原生物醫學大數據挖掘與生物信息學分析實驗室，陜西 咸陽 712082；4.滄州市中心醫院病理科，河北 滄州061000）

《本草綱目》中記載，秦艽出秦中，以根作羅紋交糾者佳，故名秦艽[1]，中藥中常用秦艽為龍膽科龍膽屬植物秦艽（Gentiana macrophyllaPall.）、麻花秦 艽（GentianastramineaMaxim.）、粗 莖 秦 艽（GentianacrasicaulisDuthie ex Burk）或 小 秦 艽（GentianadahuricaFisch.）的干燥根。其具有抗炎鎮痛、保護肝臟、心腦血管疾病防治、免疫抑制、消化促進、抗流感、抗腫瘤等作用，在風濕病、骨關節病、腦出血后遺癥、肛腸疾病、面神經炎、皮膚病、婦科疾病、應變性亞敗血癥等疾病治療方面都有顯著療效[2-3]。近代藥理研究證實，秦艽主要藥用成分為龍膽堿A、B、C，龍膽次堿，秦艽丙素及龍膽苦苷[4]，因此藥用價值極高。1985年及2000年版《中華人名共和國藥典》中規定，只有秦艽、麻花秦艽、粗莖秦艽和小秦艽可以入藥[5]，而在秦艽的中藥市場中其相近相似混偽品較多，如烏頭屬牛扁（Aconitumochranthum）、兩色烏頭（Aconitumalboviolaceum）、鼠尾草屬甘西鼠尾草（Salviaprzewalskii）、金蓮花屬 短 瓣 金 蓮 花（Trolliusledebouri）、黃 秦 艽（Veratrilla baillonii）、西 藏 黑 秦 艽（Gentiana wallonii）、中亞秦艽（Gentiana kaufmanniana）等[6]。使得秦艽的鑒別和藥效研究極為困難，也影響了秦艽的推廣和開發。

DNA條形碼技術由于其快速、準確、簡便等特點在中藥材的分類鑒定中有著廣闊的前景。常用中藥材鑒定條形碼有ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等基因序列[7-8]，羅焜等[6]利用ITS2對采自陜西、甘肅、云南、西藏等地的秦艽樣品進行基源研究，鑒定效果顯著。前期利用ITS2基因對試驗樣品進行鑒定，序列比對結果均為非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum），鑒定時易受真菌干擾。而psbAtrnH序列是葉綠體中位于編碼光合系統II反應中心的psbA基因和編碼tRNA組氨酸的trnH基因間的一段非編碼序列[9]，變異位點較多，相較于編碼區序列具有更豐富的系統發育信息[10]，且葉綠體基因在非編碼區存在較高核苷酸置換率[11]，分辨率更高，可廣泛用于中草藥的分子研究。

前期研究發現，西藏地區麻花秦艽對佐劑性關節炎大鼠原發性和繼發性病變足腫脹均有明顯的抑制作用，同時對缺氧小鼠具有抗缺氧和抗氧化的作用[12-13]。西藏、青海、四川等地3 000 m左右高海拔地區均有野生秦艽分布，而大多數生長在高海拔地區藥材處于氧含量低、日照強的環境中，其次級代謝產物具有很好的抗氧化作用[14]。

為更好地進行3個地區秦艽混偽品的區分和藥效差異分析，本試驗選取西藏、青海、四川地區5個樣品，利用psbA-trnH序列在分析樣品分類地位的基礎上，檢測其所含龍膽苦苷的含量及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率，以此評估試驗藥材的藥效及抗氧化能力，旨在為秦艽藥材的利用和開發提供科學依據，為后續藥材的鑒定和藥物開發奠定基礎，

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗的5種樣品分別為采自青海、四川和西藏3個省份5個地區的秦艽植物干燥根（表1）。所有樣品均為野生藥材，樣品收集后自然晾干保存。

表1 材料來源及psbA-trnH序列信息Tab.1 The materials source and psbA-trnH sequences information

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴增及測序 將收集的干燥根粉碎碾磨，每個樣品選取2個重復，稱取0.5 g，采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）提取植物基因組DNA。PCR擴增依照中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則，采用psbA-trnH序列引物[15]（psbA F：5'-GTT ATGCATGAACGTAATGCTC-3'；trnH R：5'-CG CGCATGGTGGATTCACAATCC-3'）進行擴增。擴增體系25 μL: 5×Prime STAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，正、反向引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 14.75 μL。序列擴增程序為94 °C預變性5 min；94 °C變 性30 s，60 °C退 火30 s，72 °C延 伸35 s，33個循環；72 °C延伸10 min。

擴增后，采用凝膠電泳檢測，之后使用DNA凝膠回收試劑盒（GE0101）進行DNA片段的純化回收并送北京擎科新業生物技術有限公司進行雙向測序。

1.2.2 分子進化分析 測序公司返回數據利用SeqMan軟件去除引物和低質量序列，并且進行拼接。將拼接的序列通過GenBank數據庫進行序列相似性分析，同時下載序列相似度較高序列為參比序列，采用Clustal X軟件[16]進行多序列比對。比對結果通過MEGA 7.0[17]計算遺傳距離（K2P）并利用鄰近法（Neighbor-Joining）[18]，采用雙參數模型（Two-parameter model）構建系統進化樹，并采用Bootstrap 1 000次檢驗進行系統發育樹的可靠性評估。

1.2.3 樣本龍膽苦苷含量檢測 樣品使用高速粉碎機粉碎后過0.15 mm篩，稱取藥粉粉末約0.1 g，加入20 mL的甲醇，超聲40 min后冷卻，負壓過濾去除藥渣后檢測，各3個重復。利用紫外分光光度法[19]對環烯醚萜類化合物中龍膽苦苷的標準品進行200～700 nm掃描測定，并找到測定的最大吸收峰，將標準品依次稀釋為7.2、10.8、14.4、18.0、21.6、25.2、28.8 mg/L，搖勻，在最大吸收峰處測定吸光度，以標準品濃度及各標準品濃度所對應的吸光度值繪制標準曲線。同時選取樣品經甲醇稀釋后進行精密度、穩定性、重復性、回收率的檢測[19]。檢測后的數值代入標準曲線方程計算龍膽苦苷濃度。

1.2.4 樣本抗氧化能力分析（DPPH清除率測定） 參考陳瀚等[20]、吳宏偉等[21]研究方法，用95%乙醇配制DPPH貯備液，濃度2.0×10-4mol/L，避光保存，現配現用。樣品經高速粉碎機粉碎后過0.15 mm篩，精密稱取0.1 g樣品并加入95%乙醇10 mL，超聲處理30 min，補齊揮發的乙醇體積。吸取1 mL稀釋100倍后作為待測液。將每種樣品溶液和DPPH等體積分別加入96孔板中，反應體系0.2 mL為樣品組（As）。以等體積95%乙醇為對照組（Ac），蒸餾水為空白組（Ao）。加樣后輕揉振蕩96孔板，充分溶解后避光放置30 min，在波長517 nm處檢測OD值。計算供試品溶液的DPPH自由基清除率，每組5個重復。

1.3 數據處理

運用軟件Excel 2010及R 4.1.2進行數據統計和作圖；同時利用SPSS 17.0中LSD最小顯著差異法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 psbA-trnH序列長度、GC含量及序列差異

測序后的原始序列拼接后，經過GenBank數據庫檢索和多序列比對后得到了psbA-trnH序列全長，5個樣品基因長度為315～392 bp，GC含量在20.32%～23.21%，每個樣品的2個重復序列及比對結果一致，完整序列上傳到GenBank數據庫，基因序列號及相關信息如表1所示，樣品序列與GenBank下載的對照序列經多序列比對后，利用MEGA 7.0進行K2P距離計算，結果如表2所示。

由表2可知，樣品XZ-001、XZ-003、SC-001與參比序列粗莖秦艽（KY595461.1）的psbA-trnH序列兩兩之間的遺傳距離均為0.000，說明西藏林芝、拉薩和四川收集的以上3個樣品序列與粗莖秦艽psbA-trnH序列無差異，應屬于粗莖秦艽；樣品XZ-002測序序列與麻花秦艽（KJ657732.1）的psbAtrnH序列之間的遺傳距離為0.000，與粗壯秦艽（Gentiana robustaKT159969.1）遺傳距離為0.003，說明XZ-002更接近于以上2個物種，應屬于麻花秦艽；樣品QH-001與黃管秦艽（Gentiana officinalisMH261261.1）遺傳距離為0.000，說明采自青海樣品應為黃管秦艽。

表2 樣品序列與參考序列的K2P距離Tab.2 The K2P distance of sample sequences and reference sequences

2.2 系統進化分析

基于psbA-trnH序列構建試驗樣品與相近物種系統進化樹（NJ）如圖1所示。

圖1 基于psbA-trnH序列構建試驗樣品與相近物種系統進化樹（NJ）Fig.1 The phylogenetic tree（NJ） constructed by test samples and neighboring species based on psbA-trnH sequences

將試驗序列及GenBank得到的參考序列共14條序列經過統一比對，利用MEGA 7.0構建系統進化樹（NJ），結果顯示（圖1），5個樣品分別聚為3支，其中，采自西藏林芝（XZ-001）、拉薩（XZ-003）、四川（SC-001）3個樣品與粗莖秦艽聚為一支，自展值為95%；XZ-001與粗莖秦艽，SC-001與XZ-003相似性分別為100%，SC-001、XZ-003與XZ-001、粗莖秦艽相似性為99.48%。由此表明，XZ-001應為粗莖秦艽，SC-001、XZ-003為同一物種，雖與粗莖秦艽相似性為99.48%，個別基因位點有差異，但還沒有到種及以上級別的區分度，因此該2個樣品應屬于粗莖秦艽。西藏昌都樣品XZ-002與麻花秦艽、粗壯秦艽聚為一支，自展值為73%，并且XZ-002與麻花秦艽基因相似性為100%，因此，確定樣品XZ-002為麻花秦艽。青海樣品QH-001與黃管秦艽聚為一支，自展值為70%，基因相似性為100%，故此，青海樣品QH-001為黃管秦艽，5個樣品的系統進化分析結果與序列的K2P距離分析結果一致。

2.3 樣品龍膽苦苷含量測定

龍膽苦苷標準品全波長掃描確定在波長270 nm有最大吸收峰，按照試驗濃度檢測吸光度并繪制標準曲線（回歸方程Y=27.550 0X+0.083 1，r=0.998），結果顯示，龍膽苦苷標準品在濃度為7.2～28.8 mg/L范圍內與吸光度值保持良好的線性關系。樣品反復測量6次，結果顯示，測量方法精密度良好（RSD=0.01%），穩定性良好（RSD=1.26%），重復性可靠（RSD=1.63%），每份樣品甲醇稀釋到不同濃度后，向其中精密加入已知濃度的適量龍膽苦苷標準品溶液，混勻后檢測其吸光度，代入標準曲線方程，計算出樣本回收率為99.12%（RSD=0.85%），表明該方法回收率良好。

樣品龍膽苦苷濃度檢測結果如圖2所示，5個樣品龍膽苦苷濃度在8.56%～12.76%，其中青海的黃管秦艽（QH-001）含量最高（12.76%），西藏昌都（XZ-002）麻花秦艽含量其次（10.47%），采自西藏林芝、拉薩及四川的3個粗莖秦艽樣品（XZ-001、XZ-003、SC-001）含量較低，都在9%左右，且3個樣品龍膽苦苷含量無顯著性差異。研究表明，龍膽苦苷具有減少急性肺損傷引起的肺內炎癥細胞及滲出物增多的作用，還可抑制炎癥因子改善小鼠結腸炎損傷，并且還具有抑制肝癌細胞、抗癲癇等作用[22-23]。藥典規定，秦艽藥材干燥品龍膽苦苷（C16H20O9）總量不少于2.5%[24]，而本次試驗樣品龍膽苦苷含量均超過9%，遠超藥典規定，開發價值巨大。

圖2 試驗樣品龍膽苦苷含量及DPPH自由基清除率Fig.2 Gentiopicroside content and DPPH scavenging rate of test samples

2.4 樣品DPPH清除率結果測定

測定5個樣品的DPPH清除率，結果表明（圖2），3個已知品種中麻花秦艽＞黃管秦艽＞粗莖秦艽，即XZ-002＞QH-001＞XZ001；值得注意的是，2個粗莖秦艽相似種XZ-003的DPPH清除率優于麻花秦艽，SC-001的清除率則介于麻花秦艽和黃管秦艽之間，且所有樣本之間差異極顯著（P＜0.01）。整體而言，5個樣品DPPH清除率為66.49%～90.68%，其中西藏林芝的粗莖秦艽近源種DPPH清除率達到90.68%。本試驗5個樣品DPPH自由基清除率均在60%以上，抗氧化能力強，可能與高海拔及野生環境的生長條件相關，需進一步深入研究。

3 結論與討論

ITS基因及葉綠體多基因片段被用于西藏、甘肅等不同地區各類秦艽及其近緣種鑒定，發現ITS序列無法鑒別粗壯秦艽及麻花秦艽[25-26]。本研究采用psbA-trnH序列對測試樣品進行分子鑒定，根據基因相似性、遺傳距離及系統進化樹位置分析，確定試驗5個樣品分屬于3個秦艽品種，分別為粗莖秦艽（XZ-001、XZ-003、SC-001）、麻花秦艽（XZ-002）和黃管秦艽（QH-001）。同時采用ITS2基因的分子鑒定發現，所測得的ITS2基因比對結果均為非洲哈茨木霉，相似性為100%，表明測序的干燥根中含有大量非洲哈茨木霉。根據羅焜等[6]對秦艽基源研究優化的試驗方法，試驗前期我們用75%乙醇進行表面清洗，但依然無法解決，可能本次試驗樣品中有大量內生真菌。說明ITS2基因序列不適于本試驗樣品分子鑒定研究。本次試驗樣品根部擁有大量非洲哈茨木霉，可能與秦艽屬植物生長或者有效藥用成分積累相關。有研究表明，木霉產生的揮發性化合物中有近400種均有生物活性，具有良好的生防效果[27]；同時，木霉可產生10余種具有廣譜抑菌性的哌珀霉素類物質[28-29]，這些物質在誘導植物抗性和抑菌方面具有重要作用。陳敬師等[30]研究表明，非洲哈茨木霉具有高產抑菌揮發性有機物的能力，是一株具有應用潛力的生防菌。因此，本次研究試驗樣品根部非洲哈茨木霉的分布與植物生長及藥用成分積累的相關性需進一步研究。

試驗樣品的龍膽苦苷含量測定顯示，采自青海的黃管秦艽含量最高，麻花秦艽其次，其余3個粗莖秦艽含量較低。根據顯著性分析結果，黃管秦艽、麻花秦艽及粗莖秦艽不同種屬間龍膽苦苷含量差異顯著，檢測的3個不同地區的粗莖秦艽樣品龍膽苦苷含量差異不顯著。而DPPH自由基清除率測定顯示，拉薩野生粗莖秦艽高達90%以上，其余藥材自由基清除率相近在70%左右，且5個樣品兩兩間差異極顯著。劉艷紅等[31]研究發現，秦艽中多酚具有清除自由基能力，并且含量豐富。在對藏藥植物抗氧化物質篩選中，亦發現烏奴龍膽苷E、大花龍膽苷A和烏奴龍膽苷A都有較強的抗氧化能力[32]。丁春發等[33]研究表明，野生麻花秦艽中龍膽苦苷具有較好的抗氧化能力，但其抗氧化能力的強弱與龍膽苦苷含量不成正比。這些充分說明，秦艽類植物應含有其他抗氧化作用的活性成分。雖然龍膽苦苷含量較高，但抗氧化能力可能有其他成分參與，其有待進一步研究探索。最后，本次采集樣品均來自3 000 m海拔左右，海拔差異600 m左右，差異不大，在后期研究中可以擴大海拔梯度采樣，同時收集相關環境因子數據，了解藥用成分和抗氧化能力差異與海拔梯度及相關環境因子的相關性。為后續該類藥材的種植和藥效研究提供思路并奠定基礎。

綜上所述，psbA-trnH序列可很好區分粗莖秦艽、麻花秦艽和黃管秦艽，不同秦艽種屬間龍膽苦苷含量及抗氧化能力差異顯著，而藥用市場秦艽來源比較復雜，利用DNA條形碼技術結合藥效評價對準確鑒別秦艽藥材、保障臨床用藥安全提供了保障。