復墾土壤凈氮礦化、硝化速率及氮相關酶活性對不同有機肥的響應

楊杰，郝鮮俊，張若揚，李 媛，高文俊，張杰

（1.山西農業大學 資源環境學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學 農業資源與環境國家級實驗教學示范中心，山西 太谷 030801；3.山西農業大學 草業學院，山西 太谷 030801）

山西省作為我國重要的煤炭能源基地，在煤炭開采過程中，造成了土地資源破壞和侵占等一系列問題，其中以采煤引起的大面積土地塌陷最為突出。截至2020年底，山西省有2 429 km2礦山發生塌陷[1]。采煤塌陷導致土壤結構與理化性質等發生改變，也加速了耕地面積銳減。黨的第十九屆五中全會中明確提出，堅守18億畝（1.2億hm2）耕地紅線，確保耕地數量的同時提高質量[2]。因此，加大采煤塌陷地土壤的復墾力度，增加耕地后備資源十分必要。采煤塌陷地治理的第一步多為工程復墾，在此過程中，由于機械碾壓和底土上翻造成了土壤結構和層次的破壞，致使耕層土壤養分匱乏。相關研究表明，礦區復墾土壤的生態恢復必須將工程復墾和生物復墾有機結合，才能實現生態環境的可持續發展[3]。

氮作為影響作物生長發育的關鍵營養物質，可以提高作物的產量和品質，因此，農民經常大量施用化學氮肥，但長期大量施用化學氮肥，不僅使土壤理化性質惡化，而且在灌溉和降水過程中，還會通過地表徑流或淋移進入地下水，造成地下水污染[4-6]。為了促進綠色農業的發展，2021年中央一號文件中提出，化肥減量增效，加強畜禽糞污資源化利用[2]。與此同時，隨著畜禽養殖的規模化發展，僅2017年我國畜禽糞尿產量就達到了4×109t左右，其中，含氮2.1×107t[7]。因此，在煤礦復墾土壤上合理施用有機肥，既可提高土壤氮素含量，又能改善土壤理化性質，達到作物穩產高產目的同時，還能實現畜禽糞肥的資源化利用。有機肥作為土壤有機氮的主要來源，盡管當季利用率低于化肥氮，但在培肥地力方面效果顯著[8-10]。有機肥中的氮素大多為有機態，作物利用率低，可被作物直接吸收的礦質氮含量極少，需要通過礦化作用將有機氮轉化成礦質氮[11-12]。郭校偉等[13]、婁燕宏等[14]、梁韻等[15]的研究均發現，單施雞糞或豬糞與不施肥或單施化肥處理相比，提高了土壤礦質氮含量。土壤酶作為一種生物活性物質，具有生物化學催化能力，參與土壤中許多重要的生化過程，對氮素的礦化也有促進作用，特別是脲酶、蛋白酶等對氮素有專性的土壤酶類[16-17]。有機肥施入土壤后，影響了土壤中酶活性，同時在土壤酶的催化下，有機肥中的有機氮礦化為可供作物吸收利用的礦質氮[5-6]。前人研究表明，施用有機肥能顯著提高土壤脲酶、天冬酰胺酶、蛋白酶等酶活性[10,18-22]。目前，關于有機肥對土壤氮素礦化及酶活性影響的報道多集中于土壤肥力較高、水熱資源豐富的地區[8-10,19-20,23-25]，但在采煤塌陷復墾土壤方面的研究較少，且為數不多的研究在施肥時多是根據農民習慣或基于當地推薦施肥量進行的粗放施肥，而忽視了有機肥中全氮的含量，并以施單一有機肥為主[5,21,26-27]。在同一氮肥水平下，施用不同有機肥對土壤氮素礦化及相關酶活性影響的研究還相對較少。

本試驗在同一施氮水平下，通過室內培養，分析化肥、雞糞、豬糞和牛糞對煤礦復墾土壤氮素礦化特征及氮轉化相關酶活性的影響，以期為合理施肥、改善復墾土壤氮素供應狀況提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

研究區位于山西省孝義市偏城村的水峪煤礦采煤塌陷區（東經111°37′，北緯37°06′），年平均氣溫為12.5 ℃，屬溫帶大陸性季風氣候，年平均降水量為428.8 mm。該試驗區在2015年塌陷穩定后，于2016年采用裝載機混推工程復墾，2017年進行定位培肥試驗。2018年采集0～20 cm表層土壤，本研究土壤采自培肥試驗中施用雞糞的小區，但未種植作物，去除異物后，常溫（25 ℃）風干、混勻過2 mm篩備用。供試土壤類型為褐土，質地為壤質黏土，2018年土壤基本理化性質為：全氮0.7 g/kg，硝態氮10.9 mg/kg，銨態氮27.0 mg/kg，有效磷22.3 mg/kg，速效鉀114.6 mg/kg，有機質7.6 g/kg，pH值8.0。

1.2 試驗材料

供試有機肥基本理化性質如表1所示。

表1 供試有機肥基本理化性質Tab.1 Basic physicochemical properties of tested organic fertilizers

供試豬糞、雞糞、牛糞均采自山西農業大學牧 站附近畜禽養殖場的腐熟有機肥，其基本理化性質如表1所示。供試化學氮肥為尿素（N 46%）。

1.3 試驗設計

試 驗 于2018年9月30日 至2019年2月3日 在山西農業大學資源環境學院微生物實驗室進行。試驗共設5個處理，分別為：不施肥空白對照、單施化肥、單施雞糞、單施豬糞、單施牛糞，每個處理3次重復。采用室內好氣培養法，稱已處理好的供試土壤500 g，裝入棕色廣口玻璃培養瓶中，使土壤含水量為田間持水量的50%，用塑料膜封住瓶口，于（25±2）℃下先預培養7 d。預培養結束后，將化肥和有機肥按不同施肥處理以300 mg/kg氮（以全N計）折算后分別施入，放置于（30±2）℃培養箱中進行培養，每天開蓋通氣1 h，每隔3 d用稱質量補水法補充水分。具體方法參照山西農業大學資源環境學院礦區土壤復墾團隊前期試驗[28]。分別于施肥培養后的第0、3、7、14、28、42、56、77、98、126天進行采樣，測定土壤含水量、銨態氮含量、硝態氮含量。綜合考慮培養天數和采樣次數，以不影響后續培養試驗為前提，分別取培養前、中、后期（第3、56、98天）的鮮土，測定土壤氮素礦化相關酶活性（脲酶、蛋白酶、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶），探究不同有機肥和化肥在土壤氮素礦化和硝化過程中對相關酶活性的影響。

1.4 測定項目及方法

土壤全氮、有效磷、速效鉀、pH值、有機質和含水量采用《土壤農化分析》[29]中的方法測定，土壤銨態氮、硝態氮含量采用1 mol/L氯化鉀浸提過濾后，用連續流動分析儀（SEAL，AA3，德國）進行測定。有機肥基本理化性質根據NY 525—2012《有機肥料》測定。土壤酶活性參照《土壤酶及其研究法》[17]進行測定。

不同有機肥對復墾土壤凈氮礦化、凈硝化速率的影響分別用公式（1）和（2）計算。

其中，NNmin為凈氮礦化速率（mg/（kg·d）），NNnitri為凈硝化速率（mg/（kg·d）），t為培養時間（0～126 d）；[NH4+]0和[NH4+]t分別是土壤中銨態氮起始濃度和培養t天的濃度（mg/kg）；[NO3-]0和[NO3-]t分別是土壤中硝態氮起始濃度和培養t天的濃度（mg/kg）。

1.5 數據分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2016進行前期處理，使用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行分析，對不同施肥處理在培養0～126 d同一采樣時期的各參數進行單因素方差分析（Duncan多重比較），對不同處理土壤銨態氮含量、硝態氮含量、凈氮礦化速率、凈硝化速率與不同酶活性之間進行偏相關性分析，統計顯著性水平均為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對煤礦復墾土壤氮素的影響

不同處理土壤銨態氮、硝態氮含量隨培養時間變化情況如圖1所示。

圖1 不同處理土壤銨態氮、硝態氮含量隨培養時間變化情況Fig.1 Changes of soil ammonium nitrogen and nitrate nitrogen content with incubation time under different treatments

由圖1可知，不施肥空白對照的土壤銨態氮、硝態氮含量在培養期間一直穩定在較低水平，分別為11.0、70.0 mg/kg。與空白對照相比，施肥處理顯著提高了土壤銨態氮含量，并且隨培養時間的增加銨態氮含量呈下降趨勢，至28 d時下降至最低水平，降幅表現為：化肥＞雞糞＞豬糞＞牛糞。培養28～126 d，施肥處理土壤銨態氮含量保持穩定，并與空白對照間差異不顯著。與銨態氮變化趨勢相反，施肥處理土壤硝態氮含量隨培養時間的延長呈增加趨勢，增加速率的大小為化肥＞雞糞＞豬糞＞牛糞（0～14 d）。14～126 d，施肥處理的土壤硝態氮含量緩慢增加，至培養結束（126 d）時，各處理土壤硝態氮含量依次為：化肥＞雞糞＞豬糞＞牛糞＞空白，且各處理間差異顯著（P＜0.05）。

2.2 不同施肥處理對煤礦復墾土壤凈礦化、硝化速率變化的影響

為進一步反映單位時間內土壤硝態氮含量，本試驗采用凈硝化速率表征土壤硝化強度隨培養時間的動態變化，如圖2所示。不施肥處理土壤凈硝化速率在培養過程中始終維持在較低水平，化肥、雞糞、豬糞處理的土壤凈硝化速率在培養初期較高，隨培養時間的延長呈下降趨勢，培養后期（98～126 d）維持在較低水平并與空白對照間無顯著差異。而牛糞處理在整個培養過程中與空白對照間差異不顯著，且其土壤凈硝化速率在3～7 d為負值，14～126 d為正值。

土壤凈氮礦化速率是指單位時間內土壤有機氮經礦化作用轉化為銨態氮、硝態氮的量，它在一定程度上決定了土壤中用于植物生長的氮素有效性[30]。總體來看，各處理土壤凈氮礦化速率變化趨勢與土壤凈硝化速率相似，說明土壤氮素礦化速率受硝化作用影響。化肥、雞糞和豬糞處理的土壤凈氮礦化速率在培養初期（3～56 d）呈下降趨勢，而牛糞處理呈上升趨勢，隨培養時間的延長，各處理凈氮礦化速率趨于穩定。各有機肥處理平均土壤凈氮礦化速率表現為：雞糞＞豬糞＞牛糞（圖2）。

圖2 不同處理土壤凈氮礦化、硝化速率動態變化Fig.2 Dynamic changes of soil net nitrogen mineralization/nitrification rates under different treatments

2.3 不同施肥處理對煤礦復墾土壤氮素礦化相關酶活性的影響

脲酶可以酶促尿素產生氨（植物氮源之一）[17]，各處理土壤脲酶活性的動態變化如圖3所示。在培養過程中，化肥處理和空白對照的土壤脲酶活性均較低，二者間差異不顯著，有機肥處理的脲酶活性顯著高于化肥處理，各有機肥處理脲酶活性表現為：豬糞＞雞糞≥牛糞（P＜0.05）。

圖3 不同處理土壤氮素礦化相關酶活性動態變化Fig.3 Dynamic changes of soil nitrogen mineralization related enzyme activities under different treatments

蛋白酶可以催化蛋白質和多肽水解為寡肽和氨基酸[31]。由圖3可知，不施肥處理的蛋白酶活性在測定的3個時期均較低，施肥后蛋白酶活性顯著提高59.5%～237.3%。在培養3～56 d，各處理蛋白酶活性基本維持穩定，56～98 d逐漸升高。培養98 d時，雞糞、牛糞和豬糞處理與空白對照相比，蛋白酶活性顯著提高了165.0%～237.3%（P＜0.05）。

酰胺酶可以破壞肽和氨基酸的C-N鍵，從而釋放氨[32]。各處理土壤天冬酰胺酶活性變化趨勢與土壤銨態氮含量大致相同，均表現為先下降后趨于穩定（圖3）。培養過程中，有機肥處理天冬酰胺酶活性顯著高于空白對照（P＜0.05）。

由圖3可知，空白對照土壤谷氨酰胺酶活性隨著培養時間延長逐漸升高，不同有機肥處理均呈先降低后升高趨勢，化肥處理則是緩慢降低，并在培養后期（98 d）顯著低于有機肥和空白對照（P＜0.05）。培養過程中，各有機肥處理土壤谷氨酰胺酶活性與空白對照間差異不顯著。

2.4 復墾土壤氮素及氮素礦化與相關酶活性的相關性分析

為進一步研究土壤酶活性與凈氮礦化、硝化速率之間的相關關系，將不同施肥處理作為控制變量進行偏相關性分析，結果表明（表2），蛋白酶與土壤硝態氮含量呈顯著正相關，相關系數達0.03。天冬酰胺酶活性與土壤銨態氮、凈氮礦化和凈硝化速率呈極顯著相關，相關系數均＜0.001，說明天冬酰胺酶活性與土壤氮素轉化密切相關。脲酶和谷氨酰胺酶活性與銨態氮、硝態氮、凈氮礦化、硝化速率無顯著相關。

表2 不同施肥處理土壤氮素及凈氮礦化、硝化速率與土壤酶活性間的相關系數Tab.2 Correlation coefficients between soil nitrogen and net nitrogen mineralization/nitrification rates and soil enzyme activities under different fertilization treatments

3 討論

3.1 施肥對復墾土壤氮素礦化的影響

礦質氮作為影響作物生長的重要營養物質，很大程度上也決定了土壤的供氮能力[11,33]。本試驗中，隨著培養時間的延長，不施肥處理土壤銨態氮和硝態氮含量保持在較低水平，而各施肥處理土壤銨態氮含量逐漸降低，硝態氮含量逐步提高，表明施肥后土壤銨態氮向硝態氮轉化，轉化的速率從大到小排序為：化肥＞雞糞＞豬糞＞牛糞，說明化肥的硝化速率高于有機肥，其凈硝化速率也顯著高于有機肥處理。這是由于本研究選用的化肥為尿素，尿素作為易分解的有機化合物，施入土壤后在脲酶作用下可快速水解為銨態氮，減少了異養硝化微生物對銨態氮的固持并激發了硝化微生物活性，提高了土壤中氮素的礦化速率，增加了氮素礦化量[12]。而在相同施氮水平下，伴隨有機肥施入土壤的有機碳含量增加，土壤微生物生長繁殖得到了所需碳源的同時固定了土壤中銨態氮以維持代謝，導致硝化作用底物減少，硝化速率也隨之降低[34-35]。本試驗培養中后期（28～126 d），各施肥處理土壤銨態氮、硝態氮含量趨于穩定，這是由于隨著土壤中易分解的有機氮和能源物質在硝化過程中被逐漸耗盡，微生物活性降低，導致銨態氮釋放量也隨之減少[36]，同時王敬等[37]研究發現，自養硝化細菌與異養微生物競爭時處于劣勢，以上均可能使得土壤凈硝化速率在培養過程中呈降低趨勢，導致培養后期各處理土壤硝態氮含量趨于穩定[14]。李玲玲[34]和劉春艷[36]也得到了類似的研究結果。

本試驗中，不同有機肥處理土壤銨態氮、硝態氮含量以及土壤凈氮礦化、硝化速率均表現為：雞糞＞豬糞＞牛糞，這與張若揚等[28]的研究結果相似，可能與有機肥的C/N有關。本研究中雞糞、豬糞和牛糞的C/N分別為10.6、12.5、19.7。李玲玲等[12]、CALDERóN等[38]、龔雪蛟等[39]研究發現，當有機肥C/N＜15時，有機肥氮素礦化速率與C/N呈顯著負相關；當C/N＞19.0時，會出現氮素凈固定。說明牛糞與雞糞和豬糞相比更容易發生氮的固定。這是因為雞和豬飼料中多添加精飼料，其中蛋白質、脂肪含量較高，而牛飼料中粗飼料占比高，并以干草和秸稈含量較多。本試驗初期（3～7 d），牛糞處理土壤的凈氮礦化、硝化速率為負值，而培養中后期（28～126 d）為正值，說明在培養初期有機氮的礦化作用較弱，以土壤氮固持為主。李平等[40]研究認為，牛糞較高的C/N會使土壤中的微生物在生長繁殖過程中對氮素需求強烈，導致硝化作用底物（銨態氮）不足，使得培養前期土壤中礦質氮的生物固持作用大于有機氮的礦化作用。隨著微生物對牛糞中能源物質（主要為碳源）的消耗，土壤對氮素的生物固持作用逐漸減弱，硝化作用底物增加，硝化速率和硝態氮含量隨之升高，在培養中后期逐漸表現為氮素的凈礦化和凈硝化[41]。

3.2 施肥后采煤塌陷區土壤的酶活性及其與土壤氮素礦化的相關性

在土壤氮素循環過程中，脲酶、蛋白酶、天冬酰胺酶和谷氨酰胺酶起重要作用，它們的酶促產物為植物氮源之一，酶活性的強弱可以作為評價土壤肥力的指標[17,42]。其中，脲酶屬于專一性水解酶類，而本研究中化肥氮雖采用尿素，但化肥處理土壤中脲酶活性卻顯著低于有機肥處理。這是由于土壤中的脲酶多來源于動植物殘體[21]，而本試驗選用土壤在培養前，已將土壤中殘留的動植物殘體等異物去除，使得脲酶含量處于較低水平。將尿素施入土壤后，在脲酶的作用下尿素逐漸水解產生銨態氮，作為酶促反應產物的銨態氮含量快速增加，從而抑制了脲酶的酶促反應，使得脲酶活性處于較低水平[43]。本試驗中，化肥對土壤脲酶、蛋白酶、天冬酰胺酶活性的影響不顯著，而雞糞、豬糞、牛糞顯著提高了土壤中這3種酶的活性，這與宋震震等[10]、張影等[22]和韓陽[44]的研究結果一致，這是因為本試驗選用的復墾土壤較為貧瘠，單施化肥不能為微生物生長繁殖提供充足的碳源和營養元素，而與化肥相比，有機肥施入土壤不僅帶入了大量酶，提高了土壤微生物種群數量，還為產酶微生物的增殖提供了充足的有機質、磷和鉀等營養物質，增加了土壤中的酶活性[45]。

本試驗結果表明，有機肥對土壤谷氨酰胺酶活性影響不顯著，而化肥處理土壤的谷氨酰胺酶活性在培養過程中呈降低趨勢。這與楊慶[23]的研究結果相似，是因為隨培養時間延長土壤中銨態氮含量下降，不足以為谷氨酰胺酶繁殖和活動提供所需的能量，導致谷氨酰胺酶活性降低。相關分析表明，本試驗中土壤銨態氮含量、凈氮礦化、硝化速率與天冬酰胺酶活性之間呈極顯著相關，這是由于天冬酰胺酶活性能夠反映土壤中含氮有機化合物的轉化動態[46]。但有研究顯示，施用有機肥（沼液）后，土壤銨態氮、硝態氮含量與天冬酰胺酶活性沒有顯著相關關系[47]。目前，關于有機肥對土壤天冬酰胺酶活性的研究較少，影響土壤酶活性的因素也較多，因此，施用有機肥對土壤中天冬酰胺酶活性的影響尚需進一步研究。

4 結論

本研究結果表明，在同一施氮水平下，單施化肥和有機肥與空白對照相比對復墾土壤氮素的礦化和硝化有促進作用，有機肥中雞糞的促進效果優于豬糞和牛糞。有機肥處理與化肥和空白對照相比顯著增加了土壤中脲酶、蛋白酶和天冬酰胺酶活性。因此，在進行礦區土壤復墾時可以選擇施用有機肥進行培肥。由于本試驗的施肥方式為單施有機肥或化肥，接下來可以對有機肥和化肥配施后礦區復墾土壤氮素的礦化特征進行研究。