層次分析-熵權法聯合響應面法優選參威骨痹片的提取工藝

陳 坤，李 江，彭 霜，董 蕓，陳凌云，余曉玲

1.達州中醫藥職業學院，達州 635000；2.云南中醫藥大學，云南省高校外用給藥系統與制劑技術研究重點實驗室，昆明 650500；3.昆明市中醫醫院，昆明 650500；4.普洱市民族傳統醫藥研究所，普洱 665000

參威骨痹方是由10余味藥材組成的中藥復方。處方中，小紅參為君藥，是云南特色民族藥[1]，來源于茜草科茜草屬云南茜草RubiayunnanensisDiels的干燥根莖[2]，具有活血化瘀、痛經止痛、祛風除濕、鎮靜、鎮痛等功效，用于痛經、閉經、風寒濕痹等[3-5]。威靈仙為治療骨痹的常用中藥，能祛風除濕、通絡止痛。白芍等中藥輔助君藥養血、活血、通絡、除痹；懷牛膝、桑寄生等中藥具有補肝益腎、健骨強筋功效；桂枝、秦艽等中藥祛風止痛、除濕散寒，全方共奏活血化瘀定痛、補益肝腎、祛風除濕之功效，臨床上主要用于風濕痹癥[1]，用藥后癥狀改善明顯，有效率達82%[6]。但為更適宜臨床用藥需求，使患者順應性更好，避免臨時煎服等缺點，本方擬開發醫療機構制劑參威骨痹片。課題組前期已經完成參威骨痹片的制備工藝及質量標準研究，且對其藥效學進行了初步研究，結果表明參威骨痹片對膝關節炎模型大鼠關節液中TNF-α有明顯的有抑制作用，提示對骨關節炎有治療效果[1]。而本文旨在闡述參威骨痹片提取工藝的優選方法，為參威骨痹片的生產提取提供數據支持。

層次分析法(Analytic Hierarchy Process，AHP)為主觀賦權法，是通過分析復雜系統中涉及的因素及其相互關系，構造復雜系統AHP法的結構模型，將各層次的要素成對比較，得出某一層次相對重要性的比較尺度，建立判斷矩陣，以最大特征值和特征向量得到相應排序，從而確定權重向量[7-8]。信息熵權重法(Entropy Weight Method，EWM)為客觀賦權法，用于衡量指標的離散程度，離散度越大，指標對綜合評價的影響就越大[9]。熵是不確定性的度量。信息量越大，不確定性和熵就越小。信息量越小，不確定性和熵就越大[10]。AHP法源于決策者的主觀抉擇，而熵權法則側重于數據本身所蘊含的客觀信息，科學的權重系數應該是主客觀相結合的結果，AHP-EWM聯合使用，既避免了AHP法的主觀抉擇，又有效利用數據本身的客觀信息，使得到的權重系數更為合理，更符合實際運行的需要[11-12]。本文以參威骨痹片提取為例，用AHP-EWM法確定各指標權重系數，有利于保證改進劑型的臨床療效，為中藥復方提取、劑型改進提供新思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀、C18色譜柱、分析天平、電子天平、數顯恒溫水浴鍋參照《熵權法聯合Box-Behnken響應曲面法優選復方龍血竭雙層膜中黃連提取工藝》一文中儀器設備[10]。

1.2 試藥

龍膽苦苷(批號為110770-201013，質量分數為98.5%)、芍藥苷(批號為110736-201842，質量分數為98.8%)均購于中國食品藥品檢定研究院；各飲片由云南中醫藥大學第三附屬醫院(昆明市中醫醫院)提供，并由云南中醫藥大學陳凌云教授進行鑒定[小紅參(批號210501)、獨活(批號210201)、桑寄生(批號210501)、威靈仙(批號210401)、防風(批號210301)、當歸(批號210501)、秦艽(批號210501)、桂枝(批號210501)、鹽杜仲(批號210401)、川芎(批號210502)、牛膝(批號210201)、茯苓(批號210501)、甘草(批號210501)、白芍(批號210501)、燈盞細辛(批號210302)、熟地黃(批號210501)]；乙腈(色譜純，批號6081001004，美國Sigma-Aldrich公司)；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

柱溫設定為30 ℃；流動相為乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B)；流速為1 mL·min-1。梯度洗脫(0～2 min，12.0%A；2～3 min，12.0%～15.0%A；3～6 min，15.0%A；6～7 min，15.0%～20.0%A；7～15 min，20.0%A；15～16 min，20.0%～60.0%A)[13]。波長切換：0～15 min在230 nm處測定芍藥苷，15～30 min在275nm處測定龍膽苦苷；進樣量為10 μL。理論板數按芍藥苷峰、龍膽苦苷峰計算分別不低于2 000、3 000。

2.2 溶液的配制

對照品溶液的制備：取芍藥苷、龍膽苦苷對照品，精密稱定，加甲醇溶解并分別稀釋成274、312 μg·mL-1的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：取處方比例藥材，根據Box-Behnken實驗安排，回流提取，濾液適當濃縮，用250 mL量瓶定容，精密吸取10 mL，置于干燥蒸發皿中，揮干，殘渣加甲醇30 mL使溶解，超聲30 min，加甲醇定容至50 mL，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照溶液的制備：按照處方比例分別制成缺白芍、秦艽的陰性樣品及兩藥均缺的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1專屬性考察 參照文獻方法[10]進行專屬性實驗。結果顯示，對照品溶液和供試品溶液中芍藥苷、龍膽苦苷色譜峰保留時間一致，且陰性對照品溶液在相應位置處無相同吸收峰，表明專屬性良好。見圖1。

2.3.2線性與范圍 按2.2項下方法配制混合對照品溶液，得芍藥苷、龍膽苦苷對照品溶液質量濃度分別為688.80、735.60 μg·mL-1。并精密吸取1、2、5、5、8 mL混合對照品儲備液，分別定容至25、25、25、10、10 mL量瓶中，得芍藥苷對照品溶液質量濃度分別為27.55、55.10、137.76、344.40、551.04 μg·mL-1及龍膽苦苷對照品溶液質量濃度分別為30.144、60.288、150.72、376.8、602.88 μg·mL-1，按2.1項下色譜條件測定，以峰面積值為縱坐標(y)，以進樣質量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(x)進行線性回歸，分別得芍藥苷、龍膽苦苷線性回歸方程分別為y=0.105 2x+0.469 8(r=0.999 9)，y=0.141x+0.492 7(r=0.999 9)，結果表明，芍藥苷和龍膽苦苷分別在進樣質量濃度27.55～688.80 μg·mL-1、30.144～735.60 μg·mL-1范圍內與其峰面積呈良好線性關系。

2.3.3精密度 參照文獻方法[10]進行精密度實驗。計算得芍藥苷、龍膽苦苷峰面積的RSD值分別為0.02%、0.13%(n=6)。結果表明，該儀器精密度良好。

注：A.芍藥苷、龍膽苦苷對照品溶液；B.供試品溶液；C.缺秦艽陰性對照溶液；D.缺白芍陰性對照溶液；E.兩藥均缺陰性對照溶液；1.芍藥苷；2.龍膽苦苷。

2.3.4穩定性 參照文獻方法[10]進行穩定性實驗。經計算，混合對照品溶液中芍藥苷、龍膽苦苷峰面積的RSD分別為0.23%、0.39%，供試品溶液中芍藥苷、龍膽苦苷峰面積的RSD分別為1.35%、1.17%。結果表明，混合對照品溶液與供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.5重復性 參照文獻方法[10]進行重復性實驗。并計算含量，得RSD值分別為1.77%、1.54%(n=6)，結果表明，該實驗方法重復性好。

2.3.6準確度實驗 精密吸取同一份已知含量的供試品溶液共9份，每份1 mL，分別按1∶0.5，1∶1，1∶1.5比例，參照文獻中穩定性考察方法[10]進行準確度實驗。計算得芍藥苷、龍膽苦苷得平均回收率分別為99.65%、99.54%，RSD 值分別為0.38%、0.75%。表明該方法加樣回收率良好[10]。見表1。

表1 芍藥苷、龍膽苦苷加樣回收實驗結果

2.4 干膏得率

參照文獻方法[14]進行提取物干膏制備實驗，計算干膏得率。

2.5 層次分析法(AHP)計算權重

層次分析法是一種定性與定量相結合的科學決策方式。它對定性問題進行量化評價，依靠決策者的主觀經驗對各評價指標進行判斷[15]。處方中，小紅參作為君藥，主要成分為蒽醌類化合物，其中明確的蒽醌類化合物有16個[16-19]，小紅參主要有抗癌作用[20]，小紅參含藥血清能夠明顯抑制T淋巴細胞對鏈球菌抗原的增殖作用、抑制NO的產生等[21]。臣藥白芍的有效成分為芍藥苷，白芍具有鎮痛、抗炎[22]、抗菌[23]、抗氧化[24]、抗癌[25]、抗抑郁[26]和抗肝纖維化[27]作用。此外，白芍對自身免疫系統疾病、神經退行性疾病和心腦血管疾病都有一定治療作用[28]；作為佐藥的秦艽主要含有環烯醚萜苷類和黃酮類化合物，臨床上主要治療骨關節炎[29-30]；干膏得率可間接反映其他藥物的提取量，也是片劑制備的主藥原料。在遵循中醫藥君臣佐使配伍理論及現代藥理作用的基礎上，將3項指標分成2個層次，并確定各指標的優先順序為：芍藥苷>龍膽苦苷>干膏得率。用AHP理論中1～9標度法對3項指標進行兩兩比較，列舉各評價指標的判斷優先矩陣，見表2。再按幾何平均法計算各指標的權重系數，得干膏得率、芍藥苷和龍膽苦苷的權重系數分別為15.132%、47.196%、37.672%。并對本次求得的各個權重系數進行一致性檢驗，得CI(一致性指標)=0.027≠0，CR(隨機一致性比率)=0.052<0.1，說明評價指標層的判斷矩陣和單排序結果通過了一致性檢驗，所求得的權重系數有效[31-32]。

表2 3種指標成分成對比較矩陣

2.6 信息熵權重法(EWM)計算權重

設響應曲面實驗原始數據為矩陣(Yij) ，將其用極值法[公式(1)]進行處理 ，轉為(0，1) 之間的數值得到響應原始矩陣[33-34]。根據公式(2) 、(3) 計算各指標信息熵Hij=[0.997 6，0.996 5，0.998 5]，得干膏得率、芍藥苷、龍膽苦苷3個指標權重系數分別為29.46%、48.95%、21.59%。

(1)

(2)

(3)

2.7 AHP-EWM混合加權法確定權重

經計算，AHP與信息熵指標權重相關系數為0.508，單因素方差分析結果為P=0.018(大于0.01小于0.05)，說明兩組權重數據相關性顯著，而非極顯著。根據復方主治功效及組方比例的特點，用AHP法量化了評價指標兩兩比較判斷的優先信息，主觀評價了各指標的權重系數，基本體現了復方君臣佐使配伍規律及各成分對總體效果貢獻的主次順序[35]，而信息熵權法的權重完全依據客觀的實驗數據，能真實地反映提取制備過程有效部位量值傳遞變化的客觀規律，因此，科學的權重確認原則應兼顧主觀權重和客觀權重。實驗用AHP-信息熵權法計算綜合權重Mi，計算公式為公式(4)。通過計算，3個評價指標的綜合權重分別為12.49%、64.72%、22.79%。

Mi=Wi-AHPWi-EWM/∑Wi-AHPWi-EWM

(4)

2.8 提取工藝優化

2.8.1因素水平設計與結果 參照文獻方法[10,14]設計實驗因素水平(課題組前期已完成該批次白芍、秦艽藥材含量的測定，其中芍藥苷、龍膽苦苷含量分別為4.69%、3.27%)，根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理進行實驗設計，各因素與水平見表3。實驗設計方案、結果見表4[10,14]。

表3 實驗因素與水平

表5 回歸模型的方差分析

2.8.2響應面分析與優化 響應曲面圖和等高線圖可準確直觀地反映出提取過程中各因素與響應值的交互作用。對綜合評分進行影響程度大小排列分析，分析結果顯示，提取次數、提取時間交互作用顯著，加水倍數、提取時間、加水倍數和提取次數交互作用結果不顯著，結論與方差分析結果一致[10]。見圖2。

2.8.3提取工藝的驗證 由上述結果可知，加水量為10 倍、提取時間為2 h、提取次數為3 次為此次提取工藝優化的最佳結果，綜合評分理論值為99.99。參照文獻中的提取工藝驗證方法進行驗證實驗[10,14]。驗證結果見表6。

圖2 響應曲面圖和等高線圖

表6 提取工藝驗證實驗

由表6可知，干膏得率、芍藥苷及龍膽苦苷轉移率均合理，綜合評分接近預測值，工藝穩定可行，具有重復性和可操作性，證明優選條件可行[10]。

3 討論

在設計提取方法時，因本方為云南省名中醫江順奎教授的經驗方，臨床使用長期有效，又擬制備院內制劑，故全方用水提取。本方藥味較多，民族藥小紅參為本方君藥之一，化學成分多為不明確的蒽醌類化合物，因其含量指標未被《中國藥典》收錄和量化，同時，課題組對復方提取液做了大黃酸、大黃素、大黃酚和蘆薈大黃素等常見蒽醌類化合物檢測，均未能檢出，故未作為評價指標；另一味君藥威靈仙，依照2020年版《中國藥典》規定對齊墩果酸進行含量測定，經檢測，齊墩果酸存在陰性干擾，亦未納入評價指標。本方中當歸、川芎、獨活等含揮發油類，受熱易分解，且不易保存；尚含有桑寄生等《中國藥典》未收錄含量測定項的中藥，暫不作為評價指標，而臣藥白芍具有鎮痛、抗炎等作用，佐藥秦艽主要含有環烯醚萜苷類和黃酮類化合物，臨床上主要作為治療骨關節炎的常用藥。綜合考慮，選擇臣藥白芍中的芍藥苷和佐藥秦艽中的龍膽苦苷作為評價指標，考慮到本方藥味眾多，成分復雜，選擇芍藥苷、龍膽苦苷及干膏得率三者共同作為評價指標。

參威骨痹方化學成分復雜，其評價指標的有效性、可測性、特有性3個核心屬性則決定臨床療效。本文圍繞參威骨痹方的3個核心屬性首次用AHP-EWM法進行其提取分析，若單純采取一種評價指標，則并不能完全控制其質量標準；若采用多標志物統一評價，則各指標之間的權重系數則會依靠人為的主觀抉擇。AHP法是根據行業專家對這3個核心要素重要性的認識而打分確定，具有一定的主觀性；EWN法的評價完全居于數據本身的客觀性，兩法合用，使得到的權重系數更為合理，更符合實際運行的需要，為后續參威骨痹片的成型工藝、藥效學及生物利用度研究奠定基礎。同時，本文所構建的AHP-EWM法對于復方提取質量的綜合評價具有較好的普適性，為中藥復方的提取評價提供新思路。