蓮芝消炎片HPLC指紋圖譜的建立及2種主要成分的測定

臧晴晴，劉飛飛，宏 偉，高 燕

1.淮南市食品藥品檢驗中心，淮南 232000；2. 山東泰和醫藥科技有限公司，濟南 250000

蓮芝消炎片由穿心蓮干浸膏和山芝麻干浸膏制成[1-3]，具有清熱解毒、涼血消腫等功效，臨床常用于治療肺胃有熱、火毒內盛引起的咳嗽氣喘、扁桃體炎、喉痹咽痛等。蓮芝消炎片現收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方制劑第二十冊，現行標準中暫時只規定了性狀、化學反應和薄層鑒別項目，暫無含量測定等指標，尚不足以全面控制其質量[4-5]。為了更加全面地評價蓮芝消炎片的質量，提高其質量標準，本實驗對蓮芝消炎片進行了HPLC指紋圖譜研究[6-15]，建立了蓮芝消炎片的HPLC特征指紋圖譜鑒別方法，并對其2種主要成分穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯進行了含量測定[16-22]，為蓮芝消炎片的質量控制和進一步研究提供了參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260液相色譜儀；Waters 2489液相色譜儀；島津LC-20AD液相色譜儀；電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，SQP)；優普系列超純水機(型號：UPT-II-10T，成都超純科技有限公司)；超聲波清洗器(ELMA S120H)。

1.2 試藥

穿心蓮內酯對照品(批號110797-202010，質量分數99.6%)，脫水穿心蓮內酯對照品(批號110854-201710，質量分數99.6%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈[色譜純，批號19125211，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、甲醇(分析純，批號20210107，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 樣品來源

不同來源的22批蓮芝消炎片批號及來源見表1。

表1 22批蓮芝消炎片樣品批號及來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱Chromcore C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；檢測波長為225 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL；流動相A(乙腈)，B(水)，梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫比例

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 取穿心蓮內酯對照品適量，加甲醇制成1.0 mg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取樣品粉末0.25 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，精密稱定，超聲處理30 min，稱定質量，用甲醇補足減失質量，濾過，取續濾液，即得。

2.3 檢測波長的選擇

為全面考察樣品中的成分，首先采用二極管陣列檢測器對供試品溶液進行紫外全波長掃描，發現在200～280 nm之間色譜峰較多，且吸收較好。進一步考察發現，在225 nm檢測波長處，樣品出峰數量較多，峰形較好且基線平穩。因此，選用225 nm作為蓮芝消炎片HPLC指紋圖譜的檢測波長。蓮芝消炎片紫外全波長掃描3D色譜圖見圖1。

圖1 蓮芝消炎片紫外全波長掃描3D色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1精密度實驗 取18號樣品(批號611073)，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行檢測，連續進樣6次，記錄色譜圖。以1號峰(穿心蓮內酯)為參照峰S，考察各共有峰的相對保留時間及峰面積。結果顯示各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.03%，峰面積RSD均小于0.02%，對指紋圖譜進行相似度評價，其相似度均為1，表明儀器精密度良好。

2.4.2重復性實驗 取18號樣品(批號611073)，按2.2.2項下方法制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。以1號峰(穿心蓮內酯)為參照峰S，考察各共有峰的相對保留時間及峰面積。結果顯示各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.03%，峰面積RSD均小于0.02%，對指紋圖譜進行相似度評價，其相似度均為1，表明方法重復性良好。

2.4.3穩定性實驗 取18號樣品(批號611073)，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、18、24 h進行測定，記錄色譜圖。以1號峰(穿心蓮內酯)為參照峰S，考察各共有峰的相對保留時間及峰面積。結果顯示各共有峰的相對保留時間RSD均小于0.06%，峰面積RSD均小于0.05%，對指紋圖譜進行相似度評價，其相似度均為1，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.4耐用性實驗 取18號樣品(批號：611073)，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別在不同品牌不同型號的液相色譜儀及色譜柱上進行測定，記錄色譜圖。結果顯示同一臺儀器不同的液相色譜柱(Agilent 1260，Chromcore C18、Diamonsil Plus C18、Ultimate XB-C18)或相同色譜柱不同的儀器(Chromcore C18，Agilent 1260、Waters 2489、島津LC-20AD)，供試品峰形和分離度均良好，表明此方法耐用性較好。

2.5 供試品HPLC指紋圖譜的測定

2.5.1共有峰確定 取22批蓮芝消炎片按2.2項下方法制備對照品溶液和供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行檢測，記錄所有色譜圖。結果顯示6個共有峰的保留時間RSD均小于0.20%。以穿心蓮內酯作為參照峰S，計算6個特征峰的相對保留時間，根據數據結果制定以下技術參數：峰1(1.00±10%)、峰2(1.07±10%)、峰3(1.13±10%)、峰4(1.52±10%)、峰5(1.68±10%)、峰6(1.74±10%)。見圖2、表3。

圖2 穿心蓮內酯對照品色譜峰

2.5.2相似度評價 以22批樣品的共有模式圖譜作為參照圖譜，在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統中(2004A版本)進行相似度評價，HPLC指紋圖譜見圖3，相似度結果見表4。

2.6 2種主要成分含量測定

2.6.1對照品溶液的確定 根據各樣品的特征圖譜，發現在22 批樣品中，峰1(穿心蓮內酯)和峰6(脫水穿心蓮內酯)的峰高較高且峰面積較大，在蓮芝消炎片的總化學成分中占比較大。因此，測定峰1和峰6的含量對控制其整體質量具有重要意義。通過對照品比對和液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS)檢測分析，確定了峰1為穿心蓮內酯，峰6為脫水穿心蓮內酯。

表3 22批樣品共有峰的相對保留時間

圖3 22批蓮芝消炎片的共有模式及HPLC指紋圖譜

表4 22批蓮芝消炎片的相似度結果

2.6.2溶液的配制 分別取穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯適量，加甲醇制成1.0 mg·mL-1的溶液，即得對照品溶液。取樣品粉末0.25 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.6.3線性關系與范圍 取穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯對照品溶液，逐級稀釋成不同質量濃度的溶液，按2.1項下色譜條件進樣檢測，以峰面積為縱坐標(y)，質量濃度為橫坐標(x)，進行回歸，結果顯示線性關系良好，見表5。

表5 穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯線性關系與范圍

2.6.4系統適用性實驗 取18號樣品(批號611073)，按2.6.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行檢測，連續進樣6次，測得穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯峰的保留時間RSD分別為0.02%、0.02%，峰面積RSD分別為0.47%、0.47%，表明儀器適用性良好。

2.6.5重復性實驗 取18號樣品(批號611073)，按2.6.2項下方法制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件進行檢測，外標法計算6份樣品的穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量RSD分別為1.48%、1.51%，表明方法重復性良好。

2.6.6穩定性實驗 取18號樣品(批號611073)，按2.6.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、18、24 h進行測定，測得穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯峰的保留時間RSD分別為0.03 %、0.03%，峰面積RSD分別為1.53%、1.37%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.6.7加樣回收率實驗 精密稱取18號樣品(批號611073)，按2.6.2項下方法制備供試品溶液6份，分別精密加入含穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣檢測，外標法計算含量和加樣回收率。結果見表6。

表6 樣品加樣回收率實驗結果 (n=6)

2.6.822批樣品含量測定 取22批樣品精密稱定，按2.6.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行檢測，用外標法計算含量，結果見表7。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

通過采用DAD檢測器對供試品溶液進行紫外全波長掃描，發現樣品溶液在200～280 nm之間色譜峰較多，且吸收較好。進一步考察發現，在225 nm波長處，基本能反映出蓮芝消炎片主要成分的整體情況。因此，選用225 nm作為蓮芝消炎片HPLC指紋圖譜的檢測波長。

3.2 流動相的考察

本實驗共考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液4種流動相體系，分別進行不同梯度的摸索。結果顯示以乙腈-水作為流動相梯度洗脫時，樣品出峰較好，基線較穩定且分離度良好。進一步考察，確定了2.1項下的流動相體系。

3.3 色譜柱及柱溫的考察

本實驗選用Agilent 1260高效液相色譜儀，分別考察了Chromcore C18、Diamonsil Plus C18、Ultimate XB-C183種色譜柱的分離效果，結果顯示，各色譜柱之間分離效果相差不大，證明本方法耐用性良好。同時，對不同的柱溫(25、30、35、40 ℃)進行考察，結果顯示30 ℃分離效果較好。

3.4 相似度及含量測定評價

本研究對22批不同來源的蓮芝消炎片進行了相似度分析，結果顯示，不同來源的樣品之間所含成分基本一致。其中13號、14號樣品相似度較低，其他20批樣品相似度均在0.90以上。在含量測定結果中，13、14、15號穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量相較于其他樣品也相對偏低，這可能是由于不同廠家對原藥材的采集加工與炮制不同所致，生產制備工藝過程也可能對含量有影響。同時穿心蓮成分在高溫下易分解也對藥品質量存在一定程度的影響。相同廠家不同批次或同一廠家相同批次間相似度和含量略有差別，不同廠家間主成分含量部分批次差別較大，詳見表7。另外，指紋圖譜結果發現，18～22號樣品有7個共有峰，其他樣品則有6個共有峰，這可能與不同的制備工藝導致藥物成分損失有關，尚需進一步研究。

4 結論

本研究建立了蓮芝消炎片的HPLC指紋圖譜并對其2種主要成分進行了含量測定，所建立指紋圖譜方法具有簡便、準確、重復性好等特點，完善了蓮芝消炎片的質量標準，為進一步的研究提供了科學依據。