注射用美羅培南聚合物雜質分析方法的比較研究

程繼業，姚 玲，周震宇，金偉斌，顧曉風

蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215104

美羅培南(meropenem)是一種半合成的廣譜碳青霉烯類抗生素，具有抗菌活性強、對β-內酰胺酶穩定、副作用小等特點，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有較強的抗菌活性[1]，臨床用于混合感染和各種嚴重感染[2-5]，尤其多用于入住重癥監護病房(Intensive Care Unit，ICU)需進行高強度的抗感染治療的患者[6]。本品對中樞神經系統及腎臟的毒副作用較小，臨床應用中不良反應發生率低，但本品屬于β-內酰胺類抗生素，在水溶液中不穩定，易產生聚合物雜質，國內外研究表明，包括聚合物在內的高分子雜質與β-內酰胺類抗生素的變態反應有密切聯系[7-9],因此建立聚合物雜質的檢測方法對保障本品質量十分重要。

《中國藥典》2020年版、《美國藥典》2021年版均收載了該品種，但均未單獨設置聚合物檢查項[10-11]。《歐洲藥典》10.0版在美羅培南原料的有關物質項下，將美羅培南二聚體(雜質B)作為特定雜質控制[12]。有文獻報道用Sephadex G-10葡聚糖凝膠色譜柱、TSK G2000SW/600以及G2000SWxl凝膠柱對美羅培南原料和制劑的聚合物雜質進行測定[13-15]。G-10色譜法操作耗時，定量準確度較低，已逐漸被高效凝膠色譜法代替[14,16]。相比G-10柱，2個G2000高效凝膠柱方法實現了對美羅培南聚合物的分離，并通過質譜法對分離得到的主要雜質結構進行推斷，為美羅培南二聚體和異構體雜質，由于缺少雜質對照品，選擇以主成分外標法[14]或自身對照法[15]對聚合物總量進行控制。

本品為2021年國家評價性抽驗品種，產品來自包括原研廠家在內的11個生產廠家，涉及包括《中國藥典》在內的7個質量標準，只有YBH00182011、YBH02582015、YBH02162016 3個標準收載了聚合物檢查方法，在對應企業產品分析中，發現3個標準存在分析時間長、方法專屬性差、色譜柱效低、分離度差等問題[17-19]。本文在上述標準基礎上選擇更高效的TSK G2000 SWxl色譜柱，優化色譜條件，建立美羅培南聚合物雜質的分析方法，對國內上市的11家企業的33批產品進行分析，并與基于《中國藥典》2020版及《歐洲藥典》10.0版開發的有關物質方法測定結果進行比較，探討高效凝膠色譜法(HPSEC)和反相高效液相色譜法(RP-HPLC)在測定抗生素聚合物方面的優劣，為本品國家藥品標準的提高提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(配DAD檢測器，Empower Pro工作站)；梅特勒托利多XSE205DU電子天平；Millipore Milli-Q超純水儀。

1.2 試藥

美羅培南對照品(中國食品藥品檢驗研究院，批號130506，按美羅培南計質量分數為86.8%)；美羅培南雜質A對照品(批號20200723，質量分數為97.95%)，美羅培南雜質B對照品(批號20201110，質量分數為95.49%)，均購自杭州卓越科技生物有限公司；注射用美羅培南(共33批，11個廠家，A～K)；三乙胺(Fisher Chemical，色譜純)；乙腈(Honeywell，色譜純)；二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸(國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純)；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 HPSEC色譜條件與測定法

色譜柱為TOSOH TSK G2000 SWxl (30 cm×7.8 mm, 5 μm)；流動相為0.01 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液-0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(61∶39，pH7.0)；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為254 nm；進樣量為20 μL。

取本品內容物，相當于美羅培南100 mg，置于50 mL量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液，溶液應臨用新制。

測定法：取供試品溶液室溫放置1 h，精密量取20 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，美羅培南雜質峰(相對保留時間約為0.8)與美羅培南峰的分離度應不小于3.0，美羅培南峰的理論板數應不低于5 000，色譜圖見圖1。精密量取供試品溶液，注入液相色譜儀，雜質峰按峰面積歸一化法計算。

2.2 RP-HPLC色譜條件與測定法

色譜柱為SUMIPAX ODS A-212(150 cm×6 mm，5 μm)；流動相為1 mL·L-1三乙胺溶液[取三乙胺1.0 mL，加水900 mL，用磷酸溶液(1→10)調pH值至5.0±0.1，加水稀釋至1 000 mL]-乙腈(93.5∶6.5)；流速為1.6 mL·min-1；柱溫為40 ℃；檢測波長為220 nm；進樣量為10 μL。

取本品內容物，用1 mL·L-1三乙胺溶液溶解并定量稀釋制成5 mg·mL-1的溶液，作為供試品溶液，溶液應臨用新制。精密量取供試品溶液1 mL，置于200 mL量瓶中，用1 mL·L-1的三乙胺溶液稀釋制至刻度，搖勻，作為對照溶液。

測定法：取美羅培南對照品適量，加1 mL·L-1的三乙胺溶液溶解并定量稀釋成0.5 mg·mL-1的溶液，置于水浴中加熱1 h，放冷，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，美羅培南峰保留時間約為7 min，出峰順序依次為美羅培南開環物(雜質A)、美羅培南與美羅培南二聚體(雜質B)，雜質A與美羅培南峰的分離度應符合要求。再精密量取供試品溶液注入液相色譜儀，記錄至主成分保留時間的3.5倍。如有雜質峰，按主成分自身對照法計算，其中雜質A 結果乘以1.6。

2.3 HPSEC法專屬性實驗用溶液配制

空白輔料溶液：本品處方中美羅培南與碳酸鈉的比例約為500∶104，據此配制空白輔料溶液。取碳酸鈉適量，加水溶解制成0.04 mg·mL-1的溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過。

酸破壞溶液：稱取美羅培南對照品約200 mg，置于100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。量取儲備液10 mL，加入1 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液，室溫放置100 min，加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液至pH 7，用0.45 μm微孔濾膜濾過。

堿破壞溶液：量取儲備液10 mL，加入1 mL 0.1 mol·L-1氫氧化鈉，室溫放置15 min，加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液溶液至pH 7，同法濾過。

氧化破壞溶液：量取儲備液10 mL，加入1 mL體積分數為30%過氧化氫溶液，室溫放置30 min，同法濾過。

高溫破壞溶液：量取儲備液10 mL，水浴60 ℃，保溫放置4 h，放冷，同法濾過。

光照破壞溶液：量取儲備液10 mL，置于光照實驗箱中，可見光4 500±500 lx/紫外光200 W·hr·m-2條件下放置20 h，同法濾過。

2.4 HPSEC法的專屬性考察

本次國評品種中，3個企業適用的國家標準YBH00182011、YBH02162016、YBH02582015指定了不同的凝膠色譜柱：1)TSKG2000 SW/600(600 mm×7.5 mm，10 μm)、2)Shodex SUGAR ks-801(300 mm×8.0 mm，6 μm)、3)賽分Cef-SEC(300 mm×7.8 mm，5 μm)，對應的典型色譜圖見圖2，3個標準均存在分析時間長、檢測結果偏高、方法專屬性差和色譜柱效低的問題。綜合實驗多種色譜柱后，本研究選擇填料粒徑更小、柱效更高的TSK G2000 SWxl (300 mm×7.8 mm，5 μm) 進行方法優化并驗證。分別取2.3項下空白輔料溶液及破壞溶液按HPSEC法色譜條件分析，記錄色譜圖。

①空白輔料在美羅培南及相關雜質處無干擾峰；②各種破壞條件均容易使美羅培南產生雜質，雜質分布于保留時間(RT)10 min至美羅培南主峰附近。③酸、堿、高溫、光照條件下均產生RT 11.9 min的主要雜質峰。用DAD檢測器獲得紫外光譜，發現酸、堿、高溫條件下的峰具有相同的光譜，而光照條件下不同，說明在RT 11.9 min處可能存在不同的雜質。④氧化破壞試驗產生雜質較復雜，超出了色譜柱的分離能力，導致雜質與美羅培南不能完全分離，其余破壞條件用DAD檢測器對美羅培南主峰質量分數檢查，峰質量分數符合要求。見圖3。

注：美羅培南與雜質峰的分離度為4.1，美羅培南峰的理論板數為13 901。

注：A.(國家藥品標準YBH00182011，色譜柱TSK G2000 SW/600); B.(國家藥品標準YBH02582015，色譜柱Shodex SUGAR ks-801); C.(國家藥品標準YBH02162016，色譜柱賽分Cef-SEC)。

2.5 美羅培南特定雜質色譜峰位確認

由于抗生素聚合物雜質制備難度較大，目前尚無法定對照品。通過對本品雜質研究文獻及國際藥典的查閱，確定美羅培南雜質A及雜質B是主要的相關雜質，基本信息見表1。商業途徑獲得了這2個雜質對照品，并對其在色譜過程中的峰位進行確認。

分別稱取雜質A、B適量，用水溶解制成0.04 mg·mL-1的溶液，按2.1項下方法進樣分析。結果雜質A與雜質B保留時間基本重合(11.9 、11.7 min)，無法分離，也解釋了在樣品測試時不同廠家產品該位置處的色譜峰形不一致，可能由雜質相對含量不同所致。雜質A、雜質B紫外光譜見表1，推測酸、堿、高溫條件下11.9 min的雜質可能為雜質A，光照條件下11.9 min的雜質與雜質B的紫外光譜存在差異，且質量分數檢查顯示大于閾值，表明該峰位處存在多種成分。

發現本方法的專屬性問題后，我們又對3個法定方法的分離能力進行了確認，結果情況相同，即法定方法均不能分離美羅培南的2個主要降解雜質，方法擬控制的聚合物雜質實際是二聚體和小分子雜質總量。查閱至2022年1月美羅培南聚合物研究的文獻，普遍認為分子排阻色譜分析美羅培南主峰前的雜質峰是聚合物，均未述及小分子雜質存在以及聚合物峰質量分數問題，可以認為，目前使用HPSEC進行美羅培南聚合物分析的方法存在一定專屬性缺陷。

注：A.酸破壞；B.堿破壞；C.氧化破壞；D.高溫破壞；E.光照破壞。

如前所述，本品種7個國家標準中，YBH00182011、YBH02582015、YBH02162016 收載了聚合物項目，且使用的色譜柱類型、定量方法各不相同，為了以相同方法和尺度對各廠家樣品進行評價，我們仍使用新建的方法，以雜質總量為指標，對方法其他參數進行驗證并評價各批次產品。

表1 美羅培南雜質A、雜質B的基本信息

2.6 HPSEC法相關方法學驗證

2.6.1溶液穩定性 取供試品溶液，室溫放置，不同時間分析，考察總雜質4 h的變化情況，結果總雜質含量由0.14%升高到0.40%，說明水溶液不穩定，應臨用新制。

2.6.2方法重復性 取1批產品，按2.1項下方法制備5份供試品，進樣分析。結果雜質峰保留時間相對標準偏差(RSD)為0.1%，與主峰分離度RSD為1.1%，雜質含量標準偏差(SD)為0.03，方法重復性好。

2.6.3線性與雜質A、雜質B校正因子的測定 取美羅培南對照品，按2.1項下方法，配制系列溶液(相當于供試品溶液中美羅培南質量濃度的0.1%～150%)；取美羅培南雜質A、雜質B對照品，同法配制系列溶液(相當于供試品溶液中美羅培南質量濃度的0.1%～2%)，分別進樣分析，記錄色譜圖，以峰面積對其質量濃度進行線性回歸，得線性方程，并計算校正因子。

美羅培南：y=12 103.0x-47 992.7，線性范圍為1.82～2 724.65 μg·mL-1，r=1.000 0。

雜質A：y=1 805.1x-597.7，線性范圍為2.05～41.00 μg·mL-1，r=1.000 0；校正因子為6.705。

雜質B：y=5 609.2x-3 536.7，線性范圍為2.01～40.20 μg·mL-1，r=1.000 0；校正因子為2.158。

2.6.4檢測限與定量限 分別取美羅培南、雜質A、雜質B對照品溶液，逐級稀釋，依法測定，按信噪比約3和10時的待測物質量濃度作為檢測限和定量限。結果見表2。

表2 檢測限與定量限實驗結果

2.6.5定量方式的考察 選取3個企業各1批樣品按2.1項下方法制備供試品溶液，并分別精密量取1 mL置于100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為自身對照溶液，進樣測定。各批樣品分別按峰面積歸一化和峰面積自身對照法計算雜質總量百分數。結果，企業A(批號2434C)為0.15%、0.16%；企業D(批號20047911)為0.39%、0.40%；企業H(批號9200301043)為0.26%、0.26%。2種定量方式所得結果一致，考慮到本品溶液狀態下的不穩定性，選擇歸一化法進行定量計算。

2.6.6方法耐用性 使用同一批樣品，對流動相pH(6.8、7.2)、流速(0.7、0.9 mL·min-1)、色譜柱溫度(25、35 ℃)小范圍變化對檢測結果的影響進行考察。結果，美羅培南理論板數、與雜質峰分離度、雜質總量檢測結果等主要參數無明顯變化。

2.7 RP-HPLC法的雜質校正因子的測定

《中國藥典》2020年版未規定美羅培南雜質A、雜質B的校正因子，歐洲藥典10.0版規定雜質A校正因子1.6，YBH02582015標準規定雜質A校正因子1.62，雜質B校正因子1.98。本文基于2個藥典方法，對雜質的校正因子進行確認。

取美羅培南對照品，按2.2項下方法，配制系列溶液；取美羅培南雜質A、雜質B對照品，按2.2項下方法，配制系列溶液，分別進樣分析，記錄色譜圖，以峰面積對其質量濃度進行線性回歸，得線性方程，并計算校正因子。

美羅培南：y=6.104 5x-0.108 9，線性范圍為0.40～40.38 μg·mL-1，r=1.000 0。

雜質A：y=3.859 0x-0.737 3，線性范圍為0.99～39.49 μg·mL-1，r=1.000 0；校正因子為1.582。

雜質B：y=5.257 7x-3.073 4，線性范圍為0.38～38.20 μg·mL-1，r=0.999 1；校正因子為1.161。

2.8 樣品測定結果的比較

將國內上市的11個企業共33批樣品分別按2.1、2.2項下方法測定，比較雜質檢測結果，見表3。其中，HPSEC法由于雜質A、雜質B不能分離，未引入校正因子，結果由峰面積歸一化法計算；RP-HPLC法中，雜質A校正因子為1.582，與《歐洲藥典》中1.6一致，雜質B為1.161，《歐洲藥典》中并未規定，考慮到測試誤差等因素，雜質B結果沒有校正。

《中國藥典》2020年版有關物質規定最大單雜質不得過0.5%，總雜質不得過1.5%。RP-HPLC法項下33批產品均符合規定，其中企業D、F、H、I雜質含量較高，接近限度，企業A、C雜質含量明顯好于其他廠商，H通過一致性評價后企業的產品雜質水平明顯低于本廠其他產品。本品制劑處方簡單，而雜質方面仍與原研產品存在明顯差距。

國家藥品標準YBH00182011、YBH02582015、YBH02162016規定聚合物雜質限度1.0%、0.8%、1.5%，HPSEC法項下所有批次產品均符合規定，且大幅低于限度。HPSEC法總雜質結果明顯低于RP-HPLC法，說明本法雜質定量結果準確性較低，可能由于在254 nm波長處檢測靈敏度低導致雜質漏檢以及雜質A、雜質B沒有引入校正因子。

表3 HPSEC和RP-HPLC 2種方法檢測雜質結果比較

3 討論

3.1 HPSEC法的專屬性

本文在YBH00182011、YBH02582015、YBH02162016 3個國家藥品標準基礎上，參考相關文獻，建立了HPSEC法對美羅培南在不同降解條件下產生的聚合物雜質進行分析，結合主要降解雜質的光譜信息并與雜質對照品峰位的比對發現，HPSEC法對分離聚合物和小分子雜質的專屬性存在問題，這也是目前用凝膠色譜方法對美羅培南聚合物進行分析的共性問題[20]。該問題的解決有待高效凝膠色譜柱填料技術的進一步提高以及多種現代色譜、質譜技術的聯合應用[21]。

3.2 HPSEC法的研究現狀和建議

在已有文獻和標準中，HPSEC法研究美羅培南聚合物通常在254 nm波長處檢測[7-9]，這對易于水解形成開環的雜質響應很低(見表1雜質A紫外光譜)，本研究在此條件下測得雜質A校正因子為6.7，二聚體雜質B校正因子為2.2，而已有文獻和標準均未采用校正因子，致使雜質含量被低估。《中國藥典》2020年版、《美國藥典》2021版和《歐洲藥典》10.0版在美羅培南原料或制劑項下均未收載聚合物檢查項，而是通過有關物質項控制，通過本文2種方法的對比也表明反相液相色譜法能夠對小分子雜質和聚合物雜質同時控制，但方法仍需改進，比如特定雜質的校正因子已經超出0.9～1.1的范圍應予引入，使定量更準確。因此，作者認為在國家藥品標準[11-13]中采用HPSEC方法控制聚合物的必要性值得商榷。