白藜蘆醇基于NF-κB p65通路對腦膠質瘤細胞的作用

晉 濤，陶勝忠，范魯鼎，李卓倫

1.鄭州頤和醫院神經外科，鄭州 450000；2.鄭州大學第二附屬醫院神經外科，鄭州 450000；3.河南中醫藥大學(河南省中醫院)神經外科，鄭州 450000；4.鄭州大學第一附屬醫院神經外科，鄭州 450000

腦膠質瘤(glioma)是發生于神經外胚層的原發性中樞神經系統惡性腫瘤，是顱內常見腫瘤，惡性程度高，浸潤性強，復發率高。白藜蘆醇是從多種植物中分離出的一種酚類化合物，具有抗癌、抗炎和抗氧化應激等功效[1-3]。白藜蘆醇可增強腦膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性，抑制腫瘤生長[4]。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞在某些刺激因子作用下獲得間質細胞表型的一種現象，廣泛存在于胚胎發育、腫瘤轉移及組織纖維化過程中。本研究以腦膠質瘤細胞U251為研究對象，探討白藜蘆醇是否通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路介導EMT過程，促進腦膠質瘤細胞的增殖和浸潤，為臨床治療腦膠質瘤提供新的治療靶點。

1 儀器與材料

1.1 儀器

多功能酶標儀購自美國BioTek公司；培養箱購自美國Thermo公司；高速冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；雙垂直電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 試藥

白藜蘆醇(質量分數>98%)購自美國Sigma公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自美國Sigma公司；細胞培養基購自美國Gibco公司；白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)和IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α) ELISA試劑盒均購自美國Abclonal公司；上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin，E-cad)、神經鈣黏蛋白(neural cadherin，N-cad)、波形蛋白(vimentin)、NF-κB p65和p-p65抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.3 細胞系

人腦膠質瘤U251細胞株購自美國ATCC公司。

2 方法

2.1 細胞培養與分組

將腦膠質瘤細胞U251培養于含體積分數10%的胎牛血清、100 mg ·L-1鏈霉素和1×105u·L-1青霉素的DMEM培養基中，37 ℃、體積分數5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每2 天更換1次培養基，細胞達到80%融合時，胰蛋白酶消化傳代，培養至第3代的U251細胞用于實驗。

對數生長期U251細胞隨機分為對照組、白藜蘆醇組、激動劑組和激動劑+白藜蘆醇組。DMEM培養基將細胞重懸，以每孔1×105個·孔-1的密度將細胞接種于96孔板，細胞貼壁生長后，對照組細胞不做處理，白藜蘆醇組細胞加入白藜蘆醇50 μmol· L-1處理12 h，激動劑組細胞加入LPS 1 μg·mL-1刺激12 h，激動劑+白藜蘆醇組細胞先用LPS刺激12 h后，再加入白藜蘆醇50 μmol·L-1處理12 h，進行實驗。

2.2 MTT法檢測細胞存活率

細胞培養24 h后，避光條件下每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，置于培養箱中繼續培養4 h，棄去原有培養基，每孔加入二甲基亞砜150 μL，37 ℃低速振蕩10 min后，置于酶標儀上，設定波長為490 nm，測定吸光度(A值)。細胞存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

細胞培養24 h后，用DMEM培養基重懸細胞，以3 000 r·min-1離心10 min，離心半徑8 cm，PBS清洗 2 次后，制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105個·mL-1，先加入 Annexin V-FITC 5 μL充分混勻后再加入碘化丙啶5 μL，振蕩混勻，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.4 ELISA法檢測IL-6、IL-1β和TNF-α表達

收集各組細胞上清液，根據說明書進行對照品稀釋，取出酶標板設定空白孔、標準孔和待測樣品孔，標準孔中加入稀釋后的對照品50 μL，待測樣品孔先加入樣品稀釋液40 μL，再加入待測上清液10 μL，37 ℃水浴鍋中孵育30 min，洗滌液洗滌5次，拍干板子，除空白孔外，其余每孔加入酶標抗體50 μL，37 ℃水浴鍋中孵育30 min，洗滌液洗滌5次，拍干板子，再加入顯色液，37 ℃顯色10 min，每孔加入終止液50 μL終止反應，酶標儀波長調至450 nm處，測量吸光度(A)值。

2.5 Transwell實驗檢測侵襲細胞數

Transwell小室的上室中鋪上30 μg基質膠，DMEM培養基將細胞重懸，調整細胞密度為105個·mL-1，在Transwell小室的上室中加入細胞懸液200 μL，在Transwell小室的下室中加入含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基500 μL，置于培養箱中培養24 h，棄掉培養基，用棉簽擦掉小室上室中的細胞，PBS清洗2次，用多聚甲醛固定15 min，用質量濃度為1 g·L-1結晶紫染色30 min，顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 蛋白印跡法檢測細胞中蛋白相對表達量

收集細胞，PBS清洗2次，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，在4 ℃ 以12 000 r·min-1離心10 min，離心半徑為10 cm，收集上清。BSA法測定蛋白質量濃度，依據標準曲線計算蛋白質量濃度。加入RIPA和蛋白上樣緩沖液調整細胞密度，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性。進行凝膠電泳，每孔加入蛋白樣品20 μL，80 V電泳30 min，120 V電泳2 h，結束電泳。0.3 A濕轉2 h，TBST洗膜5 min，3次，室溫封閉1 h，E-cad、N-cad、vimentin、NF-κB p65、p-p65和GAPDH蛋白一抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min，3次，二抗(1∶5 000)于低速搖床上室溫孵育1 h，ECL發光液A液和B液1∶1配制，顯色，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值為目的蛋白條帶相對表達量。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 細胞存活率檢測結果

細胞存活率組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，白藜蘆醇組細胞存活率降低(P<0.05)，激動劑組細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)；與白藜蘆醇組比較，激動劑+白藜蘆醇組細胞存活率升高(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+白藜蘆醇組細胞存活率降低(P<0.05)。見表1。

表1 細胞存活率比較

3.2 細胞凋亡率檢測結果

細胞凋亡率組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，白藜蘆醇組細胞凋亡率升高，激動劑組細胞凋亡率降低(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，激動劑+白藜蘆醇組細胞凋亡率降低(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+白藜蘆醇組細胞凋亡率升高(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 細胞凋亡率比較

注：A.對照組；B.白藜蘆醇組；C.激動劑組；D.激動劑+白藜蘆醇組。

3.3 ELISA檢測結果

IL-6、IL-1β和TNF-α含量組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，白藜蘆醇組IL-6、IL-1β和TNF-α含量降低，激動劑組IL-6、IL-1β和TNF-α含量升高(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，激動劑+白藜蘆醇組IL-6、IL-1β和TNF-α含量升高(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+白藜蘆醇組IL-6、IL-1β和TNF-α含量降低(P<0.05)。見表3。

表3 IL-6、IL-1β和TNF-α含量比較

3.4 Transwell實驗檢測結果

侵襲細胞數組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，白藜蘆醇組侵襲細胞數減少，激動劑組侵襲細胞數增多(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，激動劑+白藜蘆醇組侵襲細胞數增多(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+白藜蘆醇組侵襲細胞數減少(P<0.05)。見表4、圖2。

3.5 蛋白印跡法檢測結果

E-cad、N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達量組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，白藜蘆醇組E-cad蛋白相對表達量升高，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達量降低，激動劑組E-cad蛋白相對表達量降低，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達量升高(P<0.05)；與白藜蘆醇組比較，激動劑+白藜蘆醇組E-cad蛋白相對表達量降低，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達量升高(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+白藜蘆醇組E-cad蛋白相對表達量升高，N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達量降低(P<0.05)。見表5、圖3。

表4 侵襲細胞數比較

注： A.對照組；B.白藜蘆醇組；C.激動劑組；D.激動劑+白藜蘆醇組。

表5 E-cad、N-cad、vimentin和p-p65蛋白相對表達量比較

注：A.對照組；B.白藜蘆醇組；C.激動劑組；D.激動劑+白藜蘆醇組。

4 討論

腦膠質細胞瘤常引起患者神經系統功能損傷，根據病理分級，可將腦膠質細胞瘤分為4級，Ⅰ級：癌細胞增殖能力低，手術治愈性高；Ⅱ級：癌細胞具有浸潤性，有向高級別腫瘤進展的趨勢；Ⅲ級：癌細胞具有惡性腫瘤特點，術后需進行輔助性放化療；Ⅳ級：癌細胞具有惡性細胞學表象，生長快，進展快，復發率高，術后需要輔助性放化療[5-6]。臨床上常見的癥狀包括癲癇發作、顱內壓升高、頭痛、皮質脊髓束受累以及腦神經損傷等，但由于缺乏特異性常被誤診為急性腦血管疾病。目前，對于腦膠質細胞瘤的發病機制尚未明確。

中藥由于其多靶點、毒副作用小、療效佳等優點，在腫瘤的臨床治療上已受到廣泛關注，例如三七皂苷可降低胃癌細胞增殖、侵襲和遷移能力，誘導癌細胞凋亡[7]，淫羊藿苷抑制非小細胞肺癌A549細胞存活和轉移[8]。白藜蘆醇又稱芪三酚，存在于葡萄、虎杖和大麥草等多種植物中，ZHANG W等[9]研究發現白藜蘆醇通過激活Nrf2通路發揮抗炎作用，減輕糖尿病大鼠神經病變的嚴重程度。HU Y等研究報道白藜蘆醇可抑制缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡[10]。白藜蘆醇作為一種藥理活性廣泛的傳統中藥，其在抗腫瘤方面的作用已被報道，白藜蘆醇可增強肝癌細胞A549對輻射損傷的敏感性，提高肝癌的治療效果[11]。XU Q H等[12]研究發現，白藜蘆醇可通過逆轉EMT過程抑制缺氧誘導的胃癌細胞遷移和侵襲，既往研究表明，白藜蘆醇具有良好的抗腫瘤效用，但是其在腦膠質細胞瘤中是否具有抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的作用仍待研究，因此本實驗以腦膠質瘤細胞U251為研究對象，探討白藜蘆醇在腦膠質細胞瘤中的作用。實驗結果顯示，白藜蘆醇可抑制U251細胞增殖和侵襲、促進其凋亡，同時可降低炎癥因子釋放。

EMT是一個復雜的生理過程，涉及多種基因，與腫瘤細胞的遷移和浸潤密切相關。EMT發生過程中，原發灶癌上皮細胞失去上皮表型獲得間質表型，細胞骨架重構、細胞形態及生物學行為發生改變、細胞之間或細胞基質間黏附性減弱，轉變為具有遷移和侵襲能力的間質細胞，通過血液和淋巴循環轉移到遠處組織形成新的病灶。E-cad主要表達于上皮細胞，N-cad是間質細胞標志物，細胞骨架成分蛋白vimentin增高誘導EMT的發生，因此E-cad的減少和N-cad、vimentin的增加標志著EMT的發生[13]。NF-κB信號通路在細胞增殖、分化和凋亡過程中具有重要作用，而且與炎癥反應密切相關[14]，正常情況下，NF-κB主要以p65和p50二聚體形式與IKB結合于胞漿，未見生物活性，當細胞受到外界刺激時，IKB發生磷酸化而被降解，暴露NF-κB二聚體從胞漿轉移入細胞核，從而調控多種基因的轉錄，其中包括促炎細胞因子基因的表達。既往研究表明，NF-κB信號通路的激活與乳腺癌、非小細胞肺癌的增殖活性和遷移浸潤密切相關[15-16]。LIU F F等[17]研究發現，阻斷NF-κB信號通路可抑制喉癌細胞增殖遷移以及EMT過程。WANG Y S等[18]研究報道NF-κB信號通路參與調控EMT過程。黃芩素通過抑制NF-κB p65通路介導的EMT過程和炎癥反應以改善肺纖維化，白細胞介素17A激活NF-κB信號通路介導EMT促進膽囊癌侵襲[19-20]。本實驗以腦膠質瘤細胞U251為研究對象，探討白藜蘆醇抑制腦膠質細胞瘤增殖和侵襲是否與該信號通路有關。實驗結果顯示，LPS激活該信號通路后，E-cad蛋白表達減少，N-cad、vimentin蛋白表達增加，白藜蘆醇預處理后，E-cad蛋白表達增加，N-cad、vimentin蛋白表達減少，此結果提示在腦膠質瘤細胞中，白藜蘆醇可通過阻斷NF-κB信號通路抑制EMT過程。

綜上所述，白藜蘆醇可抑制腦膠質瘤細胞增殖和侵襲，促進凋亡，其可能是通過調節NF-κB信號通路抑制EMT過程、減輕炎癥反應發揮調控作用，為臨床治療腦膠質瘤提供理論依據。