丹參酮ⅡA對大鼠創面愈合瘢痕增生的抑制作用

陶 冶，張 瑱，周水勇，衛艷萍

1.鄭州人民醫院整形外科，鄭州 450003；2.焦作市人民醫院皮膚科，焦作 454002

增生性瘢痕(HS)是創傷修復的必然產物，嚴重影響機體的正常功能及美觀[1]。目前普遍采用的治療方法有激光燒灼、冷凍、放射、藥物注射等。丹參酮是從傳統中藥丹參根中提取的一類脂溶性二萜類成分，具有抗腫瘤、抗菌消炎、抑制血小板聚集、保護心腦血管等作用[2]。丹參酮ⅡA(TanⅡA)是丹參的主要有效成分之一，具有明顯的抗炎作用[3]，本研究構建大鼠背部皮膚創面動物模型，探討Tan ⅡA對大鼠創面愈合瘢痕增生的抑制作用及可能的機制，為Tan ⅡA相關藥物的研發及創面愈合的臨床治療提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7500HT型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；PowerPac電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Cheni Doc XRS化學發光成像分析系統(美國Bio-Rad公司)；RM2235型徠卡切片機(德國徠卡顯微系統貿易公司)。

1.2 試藥

Tan ⅡA(質量分數≥98%，成都曼思特生物科技有限公司)；轉化生長因子β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒均購自美國R&D公司；BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)；逆轉錄試劑盒(日本Takara公司)；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(上海欣百諾生物科技有限公司)；白介素-10(IL-10)、粒-單系祖細胞集落刺激因子(GM-CSF)一抗均購自美國Abcam公司。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠120只，10周齡，體質量(200±20) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2019-0009。實驗前適應性飼養5 d。

2 方法

2.1 大鼠模型建立

取96只大鼠建立創面動物模型。用30 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉大鼠，根據陳志勇等[4]的方法并加以改進，以俯臥位固定大鼠，剔除背部被毛，酒精消毒，用經消毒的打孔器在脊柱兩側制造2×2個直徑為10 mm的圓形創口，間隔1 cm，創口深及筋膜層，裸露不縫合，分籠飼養，不禁食水，創面自然愈合。將建模成功的大鼠隨機分為模型組及Tan ⅡA低、中和高劑量組，各24只，剩余24只未建立創面模型的大鼠作為對照組。

2.2 干預方法

Tan ⅡA溶于二甲基亞砜(DMSO)，術后30 min Tan ⅡA低、中和高劑量組分別按100、200、300 mg·kg-1劑量溶于DMSO，腹腔注射10 mL，對照組、模型組腹腔注射DMSO 10 mL[5]。每日1次，連續處理14 d。

2.3 一般指標觀察

第3、7和14天注射后1 h，每組各取3只大鼠，用滌綸投影薄膜覆蓋大鼠創面，掃描圖像計算創面面積，作為愈合面積。并記錄各組大鼠創面愈合時間，求平均值。

2.4 組織學觀察

分別于第3、7和14天注射后1 h，每組各取5只大鼠，用30 mg·kg-1戊巴比妥麻醉，模型組、Tan ⅡA各劑量組無菌剪取創面組織，對照組在脊柱兩側切取同等面積皮膚，用質量濃度100 g·L-1中性甲醛固定48 h，酒精梯度脫水，石蠟包埋后，制作4 μm的連續切片，常規HE染色，于顯微鏡下觀察瘢痕組織病理學變化，計算瘢痕增生指數(hyperplasia index, HI)。HI=瘢痕最高點到軟骨的垂直距離/正常皮膚到軟骨的距離。計數瘢痕中單位面積的成纖維細胞數量(number of fibroblasts in unit area, NA)。

2.5 ELISA檢測TGF-β1、TNF-α水平

分別于第3、7和14天注射后1 h，無菌取各組8只大鼠創面組織50 mg，加入PBS 1 mL勻漿，以8 000 r·min-1離心10 min(離心半徑為10 cm)，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行檢測，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值(A)，根據樣品吸光度值計算樣品TGF-β1、TNF-α的質量濃度。

2.6 RT-qPCR檢測mRNA表達

分別于第3、7和14天注射后1 h，無菌取各組8只大鼠創面組織置于液氮中研磨并低溫保存，各組取50 mg創面組織用Trizol法提取總RNA，測定RNA質量及質量濃度，逆轉錄獲得互補鏈cDNA，嚴格按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書操作，在熒光定量PCR儀上檢測IL-10和GM-CSF mRNA表達水平的變化。反應體系：cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，2×SYBR Green PCR Mix 10 μL，加DEPC水定容至20 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性35 s，53 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，共40個循環；以2-△△CT為目的基因IL-10、GM-CSF的相對表達強度，實驗重復3次取Ct平均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot檢測蛋白表達水平

取各組2.6項下低溫保存的創面組織100 mg，加入RIPA 0.6 mL勻漿并搖勻，靜置5 min，重復3次，于離心機離心10 min(4 ℃, 12 000 r·min-1)，取上清用BCA試劑盒進行蛋白定量，取樣本20 μg與等量上樣緩沖液混勻后進行SDS-PAGE電泳，100 V電轉30 min，轉至PVDF膜上，加入適量封閉液封閉2 h(室溫)，將膜放入1∶1 000稀釋的IL-10、GM-CSF一抗中，置于搖床中孵育過夜(4 ℃)，TBST洗膜3次×10 min，放入1∶2 000稀釋的二抗中，置于搖床中孵育1 h(室溫)，TBST洗膜3次×10 min，將PVDF膜置于顯影區，均勻滴加顯影液，用濾紙吸除PVDF膜周邊多余的顯影液，設置顯影條件，于暗室中進行曝光、顯影，用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶/內參β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 創面愈合面積、愈合時間比較

Tan ⅡA不同劑量組創面愈合時間均短于模型組(P<0.05)；注射3、7和14 d后，Tan ⅡA不同劑量組愈合面積大于模型組(P<0.05)；創面愈合面積與Tan ⅡA呈劑量依賴性增加，愈合時間與Tan ⅡA呈劑量依賴性縮短(P<0.05)；各組愈合面積隨著時間的延長而增加(P<0.05)。見表2。

表2 創面組織愈合面積、愈合時間比較

3.2 創面病理組織學觀察及HI、NA比較

注射3、7 d Tan ⅡA不同劑量組HI、NA均較模型組增加(P<0.05)；注射14 d Tan ⅡA低、中劑量組HI、NA均較模型組降低，高劑量組較模型組升高(P<0.05)。與注射3 d相比，各組HI、NA增加，與注射7 d相比，Tan ⅡA低、中劑量組注射14 d時NA降低(P<0.05)。見表3。

表3 創面組織HI、NA比較

對照組切口組織無炎性細胞浸潤。注射3 d，模型組大鼠創面組織存在明顯水腫和大量炎性細胞浸潤，無增生成纖維細胞；Tan ⅡA低、中劑量組創面組織周圍有較多壞死組織、較少成纖維細胞增生并伴輕微水腫，存在大量炎性細胞浸潤；Tan ⅡA高劑量組壞死組織較少，創面組織存在增生的成纖維細胞和大量炎性細胞浸潤。注射7 d，模型組有少量炎性細胞浸潤，間質膠原纖維增生并伴區域變性；Tan ⅡA低、中劑量組出現粗大的新生膠原纖維，其分布均勻但排列紊亂；Tan ⅡA高劑量組存在大量增生成纖維細胞，少量炎性細胞浸潤，存在間質膠原纖維增生。注射14 d，模型組大鼠可見排列紊亂的成纖維細胞，膠原纖維無明顯增生；Tan ⅡA低、中劑量組成纖維細胞減少、體積偏小，間質存在少量排列無序的膠原纖維；Tan ⅡA高劑量組新生表皮角質化明顯，存在大量成纖維細胞、少量炎性細胞浸潤。見圖1。

注：A.對照組；B.模型組；C.Tan ⅡA低劑量組；D.Tan ⅡA中劑量組；E.Tan ⅡA高劑量組。

3.3 創面組織TGF-β1、TNF-α水平比較

注射3、7、14 d TanⅡA不同劑量組TGF-β1的水平均較模型組升高，TNF-α的水平較模型組降低(P<0.05)；Tan ⅡA劑量越高，TGF-β1水平越高，TNF-α水平越低(P<0.05)；Tan ⅡA不同劑量組TGF-β1、TNF-α水平隨TanⅡ A注射時間的延長而降低(P<0.05)。見表4。

表4 創面組織TGF-β1、TNF-α水平比較

3.4 創面組織IL-10、GM-CSF mRNA表達水平比較

注射3、7、14 d Tan ⅡA不同劑量組的IL-10、GM-CSF mRNA表達水平均較模型組上升(P<0.05)；Tan ⅡA的劑量越大，IL-10、GM-CSF mRNA的水平越高(P<0.05)；Tan ⅡA不同劑量組GM-CSF mRNA的水平隨Tan ⅡA注射時間的延長而降低，IL-10 mRNA的水平隨注射時間的延長而升高(P<0.05)。見表5。

表5 創面組織IL-10、GM-CSF mRNA表達水平比較

3.5 創面組織IL-10、GM-CSF蛋白表達水平比較

注射3、7、14 d Tan ⅡA不同劑量組IL-10、GM-CSF蛋白的表達水平較模型組升高(P<0.05)；TanⅡA的劑量越大，IL-10、GM-CSF蛋白的表達水平越高(P<0.05)；TanⅡA不同劑量組GM-CSF蛋白的表達水平隨TanⅡA注射時間的延長而降低，IL-10蛋白的表達水平隨注射時間的延長而升高(P<0.05)。見表6、圖2。

表6 創面組織IL-10、GM-CSF蛋白水平比較

注：A.對照組；B.模型組；C.Tan ⅡA低劑量組；D.Tan ⅡA中劑量組；E.Tan ⅡA高劑量組。

4 討論

創面愈合是一個復雜的過程，包括止血、炎癥、增殖和重塑等階段[6]。增生性瘢痕是在某些異常因素的調控下，創面成纖維細胞過度增殖，膠原合成與分解的平衡被打破，細胞外基質大量無序沉積于組織中形成。我國傳統中藥在治療瘢痕方面有著悠久的歷史[7]。中藥的傳統功效是藥效的理論依據，丹參具有活血祛瘀、通經止痛、涼血消癰等功效，可用于治療胸痹心痛、癥痕積聚、瘡瘍腫痛等癥[8]。現代藥理研究表明，丹參具有保護血管內皮細胞、抑制膠原纖維產生和促進纖維蛋白降解及抗炎、抗氧化等作用[9-10]。Tan ⅡA是丹參的重要活性成分，在對抗纖維化疾病和炎癥疾病中具有潛在的應用前景，有望成為治療增生性瘢痕的藥物。

本研究結果顯示，Tan ⅡA各劑量組大鼠創面愈合時間短于模型組，愈合面積大于模型組，表明Tan ⅡA可加快創面愈合，抑制創面增生性瘢痕的形成。Tan ⅡA各劑量組的HI、NA均較模型組顯著增加，表明Tan ⅡA促進創面修復前中期成纖維細胞增殖以促進創面修復。HE染色結果顯示，注射3 d模型組大鼠創面組織存在明顯水腫和大量炎性細胞浸潤，無增生成纖維細胞；Tan ⅡA低、中劑量組有較少成纖維細胞增生；Tan ⅡA高劑量組存在大量增生成纖維細胞。注射7 d，Tan ⅡA高劑量組有大量增生成纖維細胞，存在間質膠原纖維增生。注射14 d，Tan ⅡA高劑量組新生表皮角質化明顯，存在大量成纖維細胞，表明Tan ⅡA可以通過成纖維細胞大量增生來促進創面組織更好、更快地愈合。由此推測，Tan ⅡA使得創面修復過程中成纖維細胞增生、減少炎性細胞浸潤、縮短創面愈合時間，并縮小愈合創面瘢痕面積，促進創面修復。既往研究顯示，Tan ⅡA可通過減輕炎癥反應，進而降低血脂和氧化應激反應，改善非酒精性脂肪肝[11]。也有研究證實，Tan ⅡA在皮膚痤瘡中具有抗炎作用[12]。本研究在大鼠創面中也觀察到相似的結果，表明Tan ⅡA可能通過發揮抗炎作用進而促進創面愈合。

炎癥細胞可以通過分泌生長因子和細胞因子參與創面愈合。GM-CSF是一種多功能生長因子，皮膚受到創傷時其會參與到創面愈合的多個階段[13-15]。GM-CSF可調控促進生長因子，如TGF等的生成，提高成纖維細胞增殖活性[16]。TGF-β1介導了多種組織纖維化反應，通過刺激間質細胞增殖產生細胞外基質[17]，促進皮膚傷口張力增加和創面局部纖維化，加速皮膚創傷愈合[18]。IL-10是減輕創面纖維化的重要因子[19]，可促進巨噬細胞抗炎因子的合成和釋放，抑制單核或巨噬細胞抗原、TNF-α受體的表達[20]。TNF-α通過提高中性粒細胞的吞噬功能而具有促進炎癥細胞分化的作用[21]。在本研究中，注射3、7、14 d TanⅡA各劑量組TGF-β1、TNF-α的水平均較模型組顯著降低，IL-10、GM-CSF mRNA和蛋白的表達水平顯著增加，表明Tan ⅡA可能是通過減輕炎性反應、增加IL-10和GM-CSF mRNA和蛋白的表達來抑制大鼠創面增生性瘢痕的產生、促進皮膚創傷愈合的。

綜上所述，Tan ⅡA通過促進創面修復過程中成纖維細胞增生、減輕炎性反應，使大鼠創面瘢痕更快、更好地愈合，減少創面愈合后瘢痕的產生，可能是通過調節IL-10和GM-CSF mRNA和蛋白的表達發揮作用，為臨床治療創面愈合提供理論依據。