新綠原酸抑制血管生成的研究

袁紅芹，王榮春，段秀英，王夢婷，陳錫強*

1.陜西步長制藥有限公司，咸陽 712000；2.齊魯工業大學生物研究所，濟南 250103；3.陜西國際商貿學院，西安 710075；4.山東省生物檢測技術工程實驗室，濟南 250103

惡性腫瘤是一類常見疾病，具有細胞分化和增殖異常、浸潤性及轉移性等生物學特征，已成為世界性難題。抑制血管生成是抗腫瘤的重要防治手段之一[1-3]。血管內皮生長因子(VEGFR)在新生血管的生成中發揮重要的調控作用[4]，其中VEGFR2是核心調控因子，抑制VEGFR2可抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，是抗腫瘤的重要機制[5]。

目前腫瘤血管新生過程參與腫瘤生長和轉移的研究已取得顯著進展，臨床研究已證實， 抑制內皮細胞VEGF信號通路可作為治療腫瘤的策略[6]。斑馬魚由于具有與人類基因組同源性較高、個體小、可大規模快速繁殖、胚體透明易于觀察，以及成本低等優勢，已經在抗腫瘤藥物研發和臨床治療研究中有著廣泛的應用[7]，由于斑馬魚早期免疫功能缺失因而容易成瘤，還可以利用斑馬魚的成像能力進行體內深層次的研究[8]。新綠原酸(5-CQA)是廣泛分布于中藥材中的活性成分，研究表明5-CQA具有廣泛的抗腫瘤活性，包括抗氧化、抗炎等活性[9-10]，本研究利用體外細胞模型和斑馬魚模型，考察5-CQA對腫瘤血管生成的影響，并研究其抗腫瘤作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo公司)；超凈工作臺(蘇州安泰凈化消毒設備廠)；二氧化碳細胞培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)；IX51型倒置顯微鏡、SZX61型體視熒光顯微鏡和FV1000型激光共聚焦顯微鏡均購自奧利巴斯有限公司；ZGENE biopco 1500型微量注射儀(力鈞生物科技有限公司)；HPG 280BX型光照培養箱(哈爾濱東聯電子科技公司)；斑馬魚養殖飼養設備(北京愛生科技發展有限公司)。

1.2 試藥

新綠原酸(質量分數≥96.5%，南通飛宇生物科技有限公司)；基質膠、DMEM高糖培養基和新鮮胎牛血清均購自美國Gibco公司；鏈霉蛋白酶E、Tricaine均購自北京索萊寶科技有限公司；實時定量熒光PCR試劑盒SYBR Primix ExTaqTM(Takara公司)。

1.3 材料

HUVEC購自 ATCC 公司；人乳腺管癌細胞T-47D由聊城大學嚴守升博士提供；野生型斑馬魚、AB品系斑馬魚和TG(flk1:EGFR)血管熒光品系由山東省科學院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺提供；SD大鼠由山東濟南朋悅實驗動物有限公司提供[SCXK(魯)20190003]。本研究經山東省科學院生物研究所實驗動物福利倫理委員會審查并批準。

2 方法

2.1 5-CQA對HUVEC增殖的影響

取處于對數生長期的HUVEC，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM重懸細胞，調整細胞密度為5×104個·mL-1，每孔100 μL接種于96孔板，置于CO2細胞培養箱中培養24 h后，每個劑量設置3個復孔， 分別設置空白對照組、5-CQA不同梯度濃度組(按照0～320 μmol·L-1梯度設置)。繼續培養48 h，加入質量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，37 ℃繼續孵育2 h后終止培養，移除培養基，加入DMSO置于脫色搖床20 min，吸取上清移入96孔板，用全自動酶標儀測定各孔490 nm處的吸光度值(A)。

2.2 5-CQA對HUVEC遷移能力的影響

預先在6孔板底部畫上標記線，將HUVEC收集計數后，按每孔4×105個細胞的密度接種于 6 孔板。待細胞生長鋪滿皿底后，用已消毒的槍頭沿縱軸劃線，用PBS反復清洗2次，除去殘留漂浮細胞，分別加入無血清的不同濃度的5-CQA(2、4、8 μmol·L-1)，繼續培養，同時設置對照組。12 h后于倒置顯微鏡下觀察和記錄HUVEC的遷移情況，實驗重復3次，取平均值。

2.3 PCR檢測HUVEC血管相關基因的表達

將HUVEC收集、計數后，按每孔4×105個細胞的密度接種于6孔板。待細胞貼壁后，加入不同濃度的5-CQA(28、56、112 μmol·L-1)并設置對照組，48 h后收集細胞，依據Trizol RNA標準分離方法抽提RNA，采用Invitrogen反轉錄試劑盒進行cDNA合成。以合成的cDNA為模板進行PCR擴增，引物序列由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1。以GAPDH作為內參。反應體系：cDNA 4 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，SYBR Mixture 5 μL，ROX 0.2 μL，加雙蒸水使總體積為20 μL。反應條件:預變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 5 s，退火、延伸60 ℃ 35 s。反應終止后，基因表達水平用2-△△Ct計算，實驗重復3次，取平均值。

表1 引物序列

2.4 5-CQA對大鼠動脈環微血管生成的影響

檢測5-CQA對大鼠動脈環血管生成的影響參照NICOSIA R F等[11]的方法進行并加以改進。取4周SD雄性大鼠2只，適應性飼養3 d，麻醉后處死、解剖，取出其主動脈，用預冷PBS清洗并剔除結締組織，剪成面積約為1 mm2的動脈環，加入已預制混合膠的48孔板中，分別加入陽性藥PTK787和不同濃度的5-CQA，平放動脈環后置于CO2培養箱中，40 min后加入0.2 mL完全培養基，每2～3 d更換1次含藥培養基，第5天用倒置顯微鏡觀察動脈內皮細胞和新生血管的生成情況，拍照記錄，用Image J軟件處理圖像。

2.5 5-CQA對斑馬魚血管生成模型的影響

斑馬魚飼養方法、取卵方法和移植瘤的造模方法參照已發表文獻[12-13]。取健康發育的TG(flk1:EGFR)斑馬魚24 h受精卵，用質量濃度為1.0 mg·mL-1的鏈酶蛋白酶E溶液脫去卵膜。在體視顯微鏡下挑選正常的斑馬魚胚胎，移入24孔培養板中，每孔12～14枚，每次每組設2個重復孔，用不同濃度的5-CQA處理孵育斑馬魚，置于28 ℃光照培養箱中讓胚胎繼續發育。48 h受精后于熒光顯微鏡下觀察，計算節間血管生成長度，并觀察胚胎死亡或畸形情況。

將斑馬魚移植瘤模型T-47D細胞置于37 ℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養。在無菌條件下將培養瓶中的T-47D細胞除去培養基，用PBS清洗2次，胰酶消化后加入含少量血清的培養基終止其消化，離心后更換新的培養基，每1 mL細胞懸液加入活細胞染色劑CM-DiL 7.5 μL，37 ℃孵育5 min，于4 ℃孵育15 min，離心棄上清，PBS清洗2次后加入無血清培養基重懸，鏡下調整細胞密度至1×106個·mL-1。

在受精卵發育48 h后，在體視顯微鏡下挑選正常的斑馬魚胚胎，移入6孔培養板中，并進行顯微注射，注射體積5 nL，4 h后在熒光倒置顯微鏡下挑選注射部位一致的斑馬魚，并加藥處理，每孔15枚，設置正常對照組、模型組、224 μmol·L-15-CQA組，然后置于28 ℃光照培養箱中讓胚胎繼續發育。48 h后將各組胚胎麻醉后用激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照，并統計熒光面積。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 MTT結果

與對照組比較，經5-CQA處理24 h后的細胞存活率明顯降低，在320 μmol·L-1時可顯著抑制細胞的增殖(P<0.05)，320 μmol·L-1及以下濃度對HUVEC的增殖無明顯影響(P>0.05)。結果見表2。

表2 5-CQA對HUVEC增殖的影響

3.2 5-CQA對 HUVEC體外遷移能力的影響

用不同濃度5-CQA處理HUVEC 12 h，鏡下可見大量細胞從劃痕邊緣向空白區域遷移，其中經5-CQA處理的HUVEC向空白區域遷移的距離較對照組明顯縮短，且細胞遷移的距離隨著5-CQA濃度的增加而縮短，見表3，表明5-CQA能夠抑制HUVEC體外遷移能力并呈劑量依賴性。

表3 5-CQA對HUVEC遷移的影響

3.3 5-CQA對HUVEC成血管相關基因表達的影響

用不同濃度5-CQA(28、56、112 μmol·L-1)處理細胞48 h，按2-△△Ct計算其VEGF、bFGF基因的表達量，與對照組相比，5-CQA可顯著抑制HUVEC中 VEGF、bFGF mRNA的表達量，見表4，表明5-CQA可通過抑制VEGF、bFGF基因的表達，抑制HUVEC成血管化并呈劑量依賴性。

表4 5-CQA對HUVEC中血管相關基因表達的影響

3.4 5-CQA對大鼠動脈環模型的影響

與對照組相比，PTK787組的微血管形成被顯著抑制(P<0.001)；與對照組比較，56、112 μmol·L-15-CQA組的微血管形成被顯著抑制(P<0.05，P<0.01)，且具有明顯的劑量依賴性，28 μmol·L-15-CQA組的微血管無明顯變化，見表5、圖1。

表5 5-CQA對大鼠動脈環模型的影響

3.5 5-CQA對斑馬魚血管生成模型的影響

對照組節間血管完整，無熒光缺失。與對照組相比，陽性藥PTK787組節間血管基本消失(P<0.001)，表明陽性對照在此條件下具有明顯活性。與PTK787組相比，224 μmol·L-15-CQA組的血管長度總值顯著降低。5-CQA各組呈現出熒光血管缺失的情況，與對照組比較，56 μmol·L-15-CQA組與112 μmol·L-15-CQA組的節間血管總長度明顯縮短(圖2A)(P<0.01)；在斑馬魚移植瘤模型中(圖2B)，可以觀察到移植瘤組SIV網狀增加，分支增多，熒光明顯增強，SIV的A值與對照組有顯著性差異(P<0.01)，224 μmol·L-15-CQA組出現SIV生長缺失，與模型組比較SIV熒光A值有顯著性差異(P<0.05)。結果見表6。

注：A.對照組；B.PTK787組；C.5-CQA 28 μmol·L-1組；D.5-CQA 56 μmol·L-1組；E.5-CQA 112 μmol·L-1組。

注：A.5-CQA對轉基因熒光血管斑馬魚模型血管生成的影響；a.對照組；b.PTK787組；c.5-CQA 28 μmol·L-1組；d.5-CQA 56 μmol·L-1組；e.5-CQA 112 μmol·L-1組；B.5-CQA對轉基因熒光血管斑馬魚移植瘤模型腸下靜脈的影響；a.明場對照組；b.熒光血管圖；c.對照組；d.移植瘤組；e.移植瘤+5-CQA 224 μmol·L-1組。箭頭所示為紅色腫瘤細胞；方框所示腸下靜脈區域。

4 討論

5-CQA是咖啡酰奎寧酸系列化合物中的一種，該化合物在植物中的分布非常廣泛[14]，是中藥材金銀花、杜仲的主要活性成分，文獻調研發現該類化合物具有廣泛的藥理活性，可通過抗氧化、抗炎和誘導凋亡發揮抗腫瘤的作用，但5-CQA抑制血管生成的作用尚未見報道。內皮細胞的遷移是血管新生的重要階段，本研究結果表明，5-CQA不僅可以顯著抑制HUVEC的增殖，并且對其遷移具有抑制作用，且呈劑量依賴性。眾多生長因子可調控血管內皮細胞的增殖、遷移及分化，從而促進生理狀態和病理狀態下的血管新生，其中最重要的生長因子是血管內皮細胞因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)[15]。VEGF參與血管內皮細胞中多種生物學狀態的調控，bFGF可與內皮細胞表面受體直接結合，誘導內皮細胞遷移、增殖以及蛋白酶分泌[16]。本研究發現5-CQA通過抑制內皮細胞中VEGF、 bFGF mRNA的表達從而發揮抑制血管生成的作用。

表6 5-CQA對轉基因熒光血管斑馬魚移植瘤模型腸下靜脈的影響

本研究利用斑馬魚模型的優勢，發現5-CQA具有抑制血管生成的活性。研究結果顯示，在不影響HUVEC增殖的條件下，112 μmol·L-1的5-CQA對大鼠動脈環微血管生成、斑馬魚的節間血管模型和移植瘤引起的SIV增生具有明顯的抑制作用。

血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)是內皮細胞中VEGF誘導的信號轉導的主要受體，在內皮細胞參與血管增殖和出芽步驟中起重要的調控作用[17-18]。綠原酸類化合物是由咖啡酸(caffeic acid)與奎尼酸(quinic acid)形成的縮酚酸，近年的研究發現，咖啡酸具有抑制血管生成和間接抑制VEGFR2表達的作用[19]。在本研究中，5-CQA能夠引起轉基因斑馬魚/移植瘤腸下靜脈VEGFR2(flk1)熒光血管的缺失，表明5-CQA具有抑制血管生成的作用，其作用機制與抑制斑馬魚VEGFR2的表達有關。

雖然CQA類化合物抗腫瘤活性一直是當今研究的熱點，但大部分集中在新靶點及體外研究，缺乏體內研究。本研究前期利用斑馬魚模型可視化和高通量的特性，完成了咖啡酸奎寧酸系列化合物的初篩，并進行斑馬魚模型的體內活性研究[20]，報道了5-CQA抑制血管生成的作用，表明5-CQA可作為潛在抗腫瘤候選天然化合物。