高良姜素對反復呼吸道感染小鼠肺功能的影響

陳志鑫，范暖東，申廣生，卜凡丹

1.南陽市中心醫院，南陽 473000；2.南陽市中醫院，南陽 473000

反復呼吸道感染(recurrent respiratory tract infection，RRTI)為兒科常見疾病，病因復雜，部分患兒病情遷延不愈，甚至誘發肺部較重的炎癥反應，嚴重影響患兒的身心健康[1-2]。高良姜素(galangin，Ga)為蜂膠及中藥高良姜中一種重要的黃酮醇類化合物，具有抗炎、抗過敏和清除自由基的藥理學活性[3]。高良姜素可通過阻斷組胺及多種炎癥介質的表達緩解肥大細胞源性過敏性炎癥，并且能夠有效抑制臭氧所致慢性阻塞性肺病小鼠、白蛋白誘導所致過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥，緩解呼吸道癥狀[4-5]。研究顯示，反復呼吸道感染引起的炎癥反應與核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)/干擾素調節因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)通路介導的細胞信號途徑有關[6]，為此本研究探討高良姜素對RRTI模型小鼠肺功能及NF-κB/IRF-3通路的影響，以期闡明其抗氣道炎癥作用的具體機制，為臨床治療RRTI提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BL-420F型生物機能實驗系統(日本奧林巴斯公司)；SW1022-ProfiBlot 48 型全自動蛋白印跡分析儀(Bioneer公司)；IX73型倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯光學有限公司)。

1.2 試藥

高良姜素(Ga，美國Sigma公司)；注射用氫化可的松琥珀酸鈉(規格:10 mg，天津生物化學制藥有限公司)；水合氯醛，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑盒均購自武漢EIAab公司；NF-κB p65、p-NF-κB p65、IRF3、p-IRF3一抗及GAPDH抗體均購自美國Abbiotec公司。

1.3 動物

SPF級雄性BALB/c小鼠40只，3周齡，體質量為12～16 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物合格證號: 202010107。動物許可證號：SCXK(京)2020-2-008。

2 方法

2.1 RRTI小鼠模型的建立及分組

將40只雄性BALB/c小鼠適應性喂養1周后，隨機分為4組：空白對照組、RRTI模型組、Ga低劑量組、Ga高劑量組，每組10只，全部操作經實驗動物管理委員會批準。除空白對照組外，其余3組參考文獻的方法[7]均采用疲勞結合飲食失節加煙熏法建立RRTI小鼠模型：連續30 d，每日將小鼠放于深15 cm，水溫25 ℃的水池中游泳，當小鼠口鼻浸入水中表明其已達耐力極限時停止游泳；實驗期間，單日給小鼠喂食白菜，每只15 g；雙日用10 mL·kg-1豬油脂灌胃，交叉喂養，自由飲水和食用飼料；在建模第15天時，使用刨花加煙葉混合煙熏小鼠，每天30 min，連續15 d；當建模小鼠出現游泳耐力明顯下降、精神萎靡、毛發枯槁易脫、弓背、瞇眼以及消瘦、咳嗽、呼吸急促等癥狀時表明造模成功。在建模同時，Ga低、高劑量干預組連續分別腹腔注射給予5、10 mg·kg-1的Ga，空白對照組及模型組則給予等量的生理鹽水。末次給藥后的第2天，空腹12 h后進行后續相關指標檢測。

2.2 RRTI模型小鼠肺功能測定

將上述各組小鼠使用水合氯醛(質量濃度0.1 g·mL-1)腹腔注射麻醉，參考文獻的方法[8]測定各組小鼠肺功能：將小鼠固定在操作臺上，頸部做縱向切口后分離氣管，氣管上做倒“T”形切口，插入并固定氣管插管，接入生物信號采集系統呼吸傳感器，記錄呼吸曲線，測定小鼠肺功能0.1 s用力呼氣容積(forced expiratory volum in 0.1 second，FEV0.1)、0.2 s用力呼氣容積(forced expiratory volum in 0.2 second，FEV0.2)、用力呼氣流量25-75(forced expiratory flow，FEF 25-75)、最高呼氣流速(peak expiratory flow，PEF)。

2.3 RRTI模型小鼠血清中炎癥因子水平檢測

各組小鼠在肺功能檢測結束后，進行腹主動脈采血，分離血清，于4 ℃靜置20 min后，以2 000 r·min-1于4 ℃離心20 min，隨后抽取上清，分裝后置于-80 ℃保存待測。采用酶聯免疫法檢測血清中IL-1β、TNF-α和IL-4的水平[9]。

2.4 模型肺泡灌洗液中炎性細胞及炎癥因子水平檢測

各組小鼠在肺功能檢測結束后，參考文獻的方法[10]，在氣管切口處插入氣管套管，用注射器抽取1 mL預冷的生理鹽水，緩慢注入小鼠肺泡內，緩慢抽出并重復3次，將收集的肺泡灌洗液于4 ℃離心15 min(3 000 r·min-1)，取上清液，按照酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒說明書操作，檢測各組小鼠肺泡灌洗液(alveolar lavage fluid，BALF) 中IL-1β、TNF-α、IL-4的表達水平；離心后的下層沉淀用生理鹽水稀釋后涂在載玻片上，采用瑞士-吉姆薩染色分類計數炎癥細胞(巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞)的數量。

2.5 RRTI模型小鼠肺組織病理學觀察

在肺泡灌洗液收集結束后，處死小鼠，分離肺組織，參考文獻的方法[11]進行蘇木素精及伊紅(HE)染色：體積分數4%甲醛溶液固定24 h，二甲苯透明，石蠟包埋，蘇木素精及伊紅染色，利用光學顯微鏡觀察支氣管、肺組織形態學及病理學改變，并進行圖像采集。

2.6 模型肺組織NF-κB/IRF3信號通路蛋白測定

分離上述各組小鼠的肺部組織，參考文獻的方法[12]制備肺組織勻漿，RIPA裂解后提取肺組織總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量。隨后常規上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經轉膜、封閉，隨后依次加入兔源單克隆NF-κB p65(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、IRF3(1∶1 000)、p-IRF3(1∶1 000)一抗，辣根過氧化物酶標志羊抗兔二抗(1∶2 000)，化學底物發光法顯色，圖像掃描分析，采用Image-QuaNT軟件測量其光密度，以各GAPDH為內參進行對照分析。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 Ga對模型小鼠肺功能的影響

與空白對照組比較，RRTI模型組的FEV0.1、FEV0.2、FEF 25-75、PEF均顯著降低(P<0.05)。與RRTI模型組比較，Ga低、高劑量組的FEV0.1、FEV0.2、FEF 25-75、PEF均顯著升高(P<0.05)，Ga高劑量組較低劑量組上述指標顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺功能比較

3.2 Ga對模型小鼠肺組織病理學的影響

空白對照組小鼠肺組織結構清晰，肺泡大小均勻，氣道黏膜上皮結構完整，纖毛排列整齊，無炎性細胞浸潤。RRTI模型組小鼠肺組織結構破壞明顯，肺泡壁塌陷，肺泡腔不規則擴大，支氣管黏膜上皮可見大量杯狀細胞增生，肺泡間質及氣道內存在大量炎性細胞浸潤，腔內可見明顯的黏液。Ga干預組小鼠肺組織損傷較模型組明顯減輕，尤其Ga高劑量組肺泡完整性較好，肺泡融合范圍明顯縮小，肺間質及氣道炎性細胞浸潤程度明顯減輕，但仍然存在少量炎癥細胞浸潤。見圖1。

注：A.空白對照組；B.RRTI模型組；C.Ga低劑量組；D.Ga高劑量組。

3.3 Ga對模型小鼠炎癥因子水平的影響

與空白對照組比較，RRTI模型組血清及肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α和IL-4的水平均顯著上升(P<0.05或P<0.01)。與RRTI模型組比較，Ga低、高劑量組血清及肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α和IL-4的水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，Ga高劑量組較低劑量組上述指標均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠炎癥因子水平的比較

3.4 Ga對模型小鼠肺泡灌洗液炎性細胞數量的影響

與空白對照組比較，RRTI模型組肺泡灌洗液中巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞的數量均顯著增加(P<0.05)。與RRTI模型組比較，Ga低、高劑量組肺泡灌洗液中巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞的數量均顯著減少(P<0.05)，Ga低、高劑量2組間上述指標的差異有統計學意義(P<0.05)。Ga高劑量組較低劑量組肺泡灌洗液中的上述炎性細胞數量顯著減少(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠炎性細胞數量的比較

3.5 Ga對模型小鼠NF-κB/IRF3信號通路的影響

與空白對照組比較，RRTI模型組肺組織中p-IRF3/IRF3、p-NF-κB p65/NF-κB p65的相對表達量均顯著增加(P<0.05)。與RRTI模型組比較，Ga低、高劑量組肺組織中p-IRF3/IRF3、p-NF-κB p65/NF-κB p65的相對表達量均顯著降低(P<0.05)，Ga高劑量組較低劑量組肺組織中上述通路蛋白的表達量均顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠NF-κB/IRF3信號通路蛋白表達比較

4 討論

Ga可通過Nrf-2-Keap1抗氧化系統有效抑制慢性阻塞性肺病小鼠氣道炎癥的發生和發展，同時Ga可降低哮喘小鼠多種炎癥因子的表達，減輕哮喘小鼠氣道炎癥，改善慢性阻塞性肺病小鼠和哮喘小鼠的呼吸道癥狀[13-14]。在本研究中，Ga能明顯改善RRTI模型小鼠FEV0.1、FEV0.2、FEF 25-75、PEF等肺功能指標，病理學結果顯示，Ga干預組小鼠肺泡融合范圍明顯縮小，肺間質及氣道炎性細胞浸潤程度明顯減輕，表明Ga能明顯降低RRTI模型小鼠氣道受阻的程度，改善肺功能。因此，Ga對于改善反復呼吸道感染的肺功能同樣具有較好的療效。

小兒反復呼吸道感染可伴發呼吸道多種炎癥細胞及炎癥介質的釋放，明顯存在嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和肥大細胞等炎癥細胞的浸潤，其中嗜酸性粒細胞還可通過釋放前炎癥介質和細胞毒性介質來調節氣道炎癥[15-16]。TNF-α作為一種強有力的致炎癥因子，可以刺激呼吸道中白細胞和內皮細胞表達黏附分子，并上調其他致炎細胞因子的表達[17]；IL-1β及IL-4作為人體內重要的前炎癥細胞因子，可激活和募集上述炎癥細胞，加重人體呼吸道的炎癥反應[18]；在本研究中，Ga能夠明顯減少RRTI模型小鼠肺泡灌洗液中巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞的數量，顯著降低血清及肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α、IL-4的水平，表明Ga能明顯抑制RRTI模型小鼠氣道炎癥，減少炎癥細胞浸潤，緩解機體的炎癥反應和因炎癥誘導的肺損傷。

反復呼吸道感染存在的炎癥反應與NF-κB/IRF-3介導的細胞信號途徑有關，多種呼吸道感染物可激活IRF-3和 NF-κB信號，促使下游促炎因子的過度表達和釋放，增強細胞基質的合成，從而影響氣道炎癥反應[19-20]。研究顯示，柴胡提取物可通過抑制NF-κB信號減少IL-1β、 IL-4、TNF-α等炎性因子的產生和聚集，從而改善哮喘小鼠的呼吸道炎癥[21]。在本研究中，RRTI模型小鼠均存在NF-κB和IRF3的活化，表明RRTI模型小鼠的氣道炎癥與NF-κB/IRF-3的異常激活有關；在給予Ga干預后，NF-κB和IRF3的活化均受到抑制，同時IL-1β、TNF-α、IL-4等炎癥因子的水平明顯降低，表明Ga對RRTI模型小鼠氣道炎癥的緩解作用與抑制NF-κB/IRF-3信號通路、減少炎癥因子的產生有關。

綜上所述，Ga可改善RRTI模型小鼠肺功能、減輕炎癥反應，其作用機制可能與調控NF-κB/IRF-3信號通路、降低炎癥因子水平和減少炎性細胞數量有關。