星點設計效應面法優化一氧化氮供體型姜黃素膠束的制備工藝

鐘榮生, 饒小勇,3，房元英,3，何 雁, 陸浩偉，劉 微,3*，羅曉健,3*

1.江西中醫藥大學，南昌 330004；2.江西中醫藥大學附屬醫院，南昌 330006；3.中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，南昌 330006

姜黃素(curcumin, Cur)是從中藥姜黃中提取的一種黃色多酚化合物，是一種強天然抗氧化劑，可預防多種疾病，通過抗氧化、抗炎等作用治療動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病及腦梗死等疾病[1-3]。但Cur的水溶性較差，生物利用度低，進入體內后很快轉化成葡萄糖醛酸結合物而快速排出體外，限制了其應用[4-7]。因此，在治療腦梗死時，改善Cur溶解度低、透過血腦屏障差等問題，是提高其腦內轉移率的重點。

聚合物膠束是由雙親聚合物在選擇性溶劑中發生微相分離形成的具有疏水性核與溶劑化殼的一種自組裝結構，能增加藥物溶解度，借助自身粒徑小的優勢，協助藥物透過血腦屏障，且成本較低，易于產業化生產[8-12]，已經成為近年來研究及應用的熱點。

在前期實驗基礎上，確定的關鍵因素有膠束比例、表面活性劑比例、藥物輔料比例、制備溫度等。為了滿足應用要求，提高膠束對Cur的載藥率，本研究用星點設計效應面法對Cur-PLA-NO的制備處方及工藝進行優化，以期利用膠束載藥系統的制劑特性提高Cur的溶解度和血腦屏障透過率。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；METTLER TOLEDO MS205DU十萬分之一天平[梅特勒托利多科技(中國)有限公司]；CO2細胞培養箱(美國賽默飛世爾科技公司)；Zetasizer Nano ZS90型納米粒度儀(英國馬爾文公司)；ZNCL-GS型磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；GZLY-1型冷凍干燥機(北京松源華興科技發展有限公司)；Millicell ERS-2、MillicellTranswell Inserts均購自Millipore公司。

1.2 試藥

姜黃素原料藥(質量分數為98%，南京春秋生物工程有限公司)；mPEG-PLA-NO為自制(專利號：CN107998405A)；叔丁醇(分析純，上海麥克林有限公司)；吐溫80(質量分數為98%，天津市大茂化學試劑廠)；L-半胱氨酸(質量分數為98%，日本東京化成工業株式會社)；胎牛血清(fatal bovine serum, FBS，美國Gemini公司)；DMEM(高)，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)均購自美國Hyclone公司；聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯(polyoxyl 15 hydroxystearate, HS15，北京鳳禮精求醫藥股份有限公司)；bEnd.3 細胞完全培養基(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.3 細胞

bEnd.3細胞來源于美國ATCC細胞庫。

2 方法

2.1 Cur-PLA-NO的制備

用溶劑蒸發法制備Cur-PLA-NO[13]。精密稱取姜黃素、mPEG-PLA-NO和聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯(polyoxyl 15 hydroxystearate, HS15)，加入溶劑叔丁醇，60 ℃磁力攪拌1 h，加入純化水，攪拌20 min，靜置至室溫，加入質量濃度1 mg·mL-1甘露醇攪拌至溶解，過0.22 μm濾膜后，-20 ℃預凍7 h，緩慢降溫抽真空凍干，即得Cur-PLA-NO。

2.2 姜黃素的含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱為Diamonsil 5 μm C18(250 mm×4.6 mm)；流動相為冰醋酸水溶液(40 mL·L-1)-乙腈(52∶48)；檢測波長為430 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min-1；進樣量為10 μL。

2.2.2主要溶液的配制 對照品溶液：精密稱定姜黃素對照品20.00 mg，置于25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品儲備液。取上述儲備液12.5 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀釋定容，搖勻即得質量濃度為0.40 mg·mL-1的對照品溶液，備用。

供試品溶液：用純化水復溶Cur-PLA-NO，得質量濃度為0.702 mg·mL-1的膠束溶液，精密量取膠束溶液0.1 mL，置于1 mL量瓶中，用甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，靜置，經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得Cur-PLA-NO供試品溶液。

2.2.3線性關系與范圍 精密量取10 mL對照品溶液，依次用甲醇稀釋成質量濃度為0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg·mL-1的系列溶液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，按色譜條件依次進樣，記錄色譜峰面積。以峰面積(A)為縱坐標，對照品質量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸。

2.3 星點設計優化Cur-PLA-NO處方工藝及驗證

根據前期單因素實驗結果，選擇聚合物mPEG-PLA-NO投入量(x1, g)、乳化劑HS15投入量(x2, g)和制備溫度(x3, ℃)3個對膠束質量濃度影響較大的因素，設計三因素三水平實驗方案，共進行17 次實驗。其中聚合物投入量、乳化劑投入量、制備溫度的優化范圍分別為0.04～0.10 g、0.04～0.08 g、40～70 ℃。通過星點設計效應面法篩選出最佳聚合物膠束的制備工藝，并按照最優處方工藝條件制備Cur-PLA-NO，測定姜黃素質量濃度，將實測值與預測值平行對比，計算兩者間的誤差。

2.4 包封率與載藥率的測定

用高效液相色譜法測定并計算Cur的包封率與載藥率。精密吸取膠束溶液400 μL，置于超濾離心管(相對分子質量為3 kDa)中，4 ℃以14 000 r·min-1離心15 min，吸取離心液及未離心膠束，按照2.2.1項下色譜條件進行含量測定，計算Cur-PLA-NO的包封率(encapsulation efficiency, EE)與載藥率(drug loading, DL)。

DL=W負載÷(W負載+W膠束)×100%；

EE=W負載÷W總×100%。

W負載表示負載在膠束中姜黃素的質量，W總表示未離心膠束姜黃素的質量，W膠束表示膠束中聚合物的質量。

2.5 平均粒徑和Zeta電位的測定

取適量2.2.2項下制備的Cur-PLA-NO溶液，用純化水稀釋至適宜質量濃度，室溫下用粒徑分析儀測定粒徑及Zeta電位，每份樣品測定3次。

2.6 姜黃素體外釋放行為的研究

用PBS(pH 7.4)復溶Cur-PLA-NO至姜黃素質量濃度為0.75 mg·mL-1，取1 mL置于透析袋(醋酸纖維素酯，相對分子質量為300 kDa)中，以100 mL的1×PBS(室溫條件下質量濃度10.5～11 mg·mL-1吐溫80和3.5 mmol·L-1的L-半胱氨酸)為溶出介質[14]，通過流池法溶出度儀收集溶出液，用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)測定姜黃素含量，計算不同時間點Cur-PLA-NO中姜黃素的溶出百分率。

2.7 Cur-PLA-NO體外透過血腦屏障行為的研究

將bEnd.3細胞(2.25×105個·孔-1)接種于24孔Transwell 膜(0.4 μm，透孔聚酯膜)上，建立血腦屏障模型[15-16]。再用bEnd.3專用完全培養基培養7 d后，置于顯微鏡下觀察，待細胞呈鋪路石狀態后，用Millicell ERS-2伏特歐姆測定跨內皮細胞電阻(TEER)，評價血腦屏障體外細胞模型的完整性。TEER大于200 Ω·cm2則認為細胞具有完整性，可用于進一步的滲透性測試[17]。

在Transwell 上室分別加入含有Cur溶液(質量濃度30 μg·mL-1)、Cur-PLA-NO(質量濃度30 μg·mL-1)的培養基，見圖1。下室加入新鮮培養基，孵育5 h 后，收集上層、細胞層和過濾層的溶液，用HPLC法測定3層中的含量。以此來判斷2種溶液的滲透性。

透過率=過濾層質量濃度÷總質量濃度×100%。總質量濃度為上層溶液、細胞層溶液、過濾層溶液的總質量濃度。

圖1 體外血腦屏障模型的構建

3 結果

3.1 線性關系與范圍

經回歸得姜黃素的線性回歸方程為A=8×107C-181 908，R2=0.999 4。結果表明，姜黃素質量濃度在0.012 5～0.8 mg·mL-1范圍內時線性關系良好。

3.2 星點設計優化Cur-PLA-NO處方工藝及驗證結果

3.2.1星點設計優化Cur-PLA-NO處方 選擇中心點為5的Box-Behnken設計，共進行17次實驗，具體實驗安排及結果見表1。

表1 星點設計效應面響應法實驗安排及結果

3.2.3最佳工藝驗證 根據前期單因素考察結果，溫度設置在40～60 ℃，響應值質量濃度穩定在0.18～0.79 mg·mL-1范圍內有利于保持制劑的穩定性。根據星點設計效應面法得到Cur-PLA-NO最優處方工藝：姜黃素、mPEG-PLA-NO及HS15的投入質量比例為1∶20∶15，叔丁醇加入量為20%，以500 r·min-1，55 ℃恒溫磁力攪拌1 h，即得。在所選最佳處方工藝下，Cur-PLA-NO的載藥量為(0.702±0.08) mg·mL-1；平均粒徑為(26.41±0.35) nm，PDI為0.231±0.005，Zeta電位為(-13.25±0.35) mV。見表3和圖3。實驗結果表明，預測值與實測值的相對偏差為1.00%，表明該工藝準確可靠，重復性良好，經星點設計實驗建立的數學模型預測性良好。

表2 回歸模型的方差分析

圖2 3個因素對Cur-PLA-NO質量濃度(y)的響應面圖

表3 驗證及重復性結果

3.3 Cur-PLA-NO體外釋放行為的研究結果

實驗結果表明，Cur-PLA-NO溶液在60 h內總釋放量僅為55.43%±0.006%，見圖4，表現出膠束的緩釋特性。采用OriginPro 2018C 軟件，對姜黃素體外釋放曲線進行擬合得方程，見表4。由表4可見，Cur-PLA-NO姜黃素體外釋放過程較符合一級動力學方程。

圖3 最優處方驗證粒徑分布

圖4 在pH7.4條件下Cur-PLA-NO中姜黃素的釋放曲線 (n=3)

表4 姜黃素膠束的不同體外釋藥模型擬合方程

3.4 Cur-PLA-NO體外透過血腦屏障行為的結果

Cur-PLA-NO體外跨血腦屏障行為的結果見圖5。結果表明，Cur-PLA-NO中Cur的血腦屏障透過率較Cur溶液更高，分別為42.2%±0.003%、27.5%±0.003%，表明水溶性差的藥物通過兩親性嵌段制備成小分子膠束后，能夠協助藥物透過血腦屏障。

注：與Cur組比較，**P<0.01。

4 討論

本實驗采用星點設計效應面法優化Cur-PLA-NO膠束的處方及工藝，得到回歸模型，比較各因素的顯著性和各因素之間的交互作用，優選出Cur-PLA-NO膠束制備處方工藝的最佳條件：姜黃素、mPEG-PLA-NO及HS15的投入質量比為1∶20∶15，叔丁醇加入比例為20%，以500 r·min-1、55 ℃恒溫磁力攪拌1 h。在所選最佳處方、工藝下，Cur-PLA-NO的粒徑均勻、可控，為(26.41±0.35) nm，電位準確、穩定，為(-13.25±0.35) mV，包封率和載藥量較高，分別為97.23%±0.17%、3.38%±0.05%，表明所建立的模型及所選工藝參數可靠，具有良好的預測性。

為了盡可能接近體內生理條件，選用pH為7.4的PBS為溶出介質，但Cur在弱堿性條件下易變性，導致溶解度降低[18]，在PBS中無法被檢測出來。研究表明，采用含吐溫80的PBS，能明顯改善Cur的溶解性與穩定性[19-21]。Cur-PLA-NO累積釋放結果亦表明，Cur在40 h前釋放較快，此后釋放速率減慢直至60 h后基本保持不變，整個過程中未發生突釋現象，可能歸因于聚合物膠束的核殼結構。表明Cur-PLA-NO雖然不能保持恒定的釋放速率，但符合一級動力學模型的要求，以相關系數為判斷依據，具有從快速到緩慢釋放的變化[22]。

血腦屏障是主要由腦微血管內皮細胞構建的屏障，可防止大分子進入大腦[23]。2種溶液的血腦屏障透過率結果表明，Cur溶液能夠透過體外血腦屏障，這可以解釋為Cur本身是脂溶性很強的小分子(油水分配系數lgP4.16[24]，lgP越高，血腦屏障滲透率越高)。而將其封裝在mPEG-PLA-NO中后，Cur-PLA-NO中Cur的血腦屏障透過率更高，約是Cur溶液的1.5倍，可能是由于分子體積占據主導作用，顯著增加了Cur的血腦屏障透過率，且mPEG-PLA嵌段上增加的呋咱環型NO供體化合物，改變了共聚物嵌段的化學組成、長度與親脂性，表現為與小鼠腦內皮細胞更加活躍的積極作用，同時Cur-PLA-NO表面帶有的負電荷與血清蛋白互相排斥，這都有利于Cur-PLA-NO透過血腦屏障進入腦部發揮治療作用。

綜上所述，本實驗采用星點設計效應面法對Cur-PLA-NO的制備處方工藝進行了優化，最終確定的最佳制備條件具有耗時短、包封率高及易產業化等優點。同時通過體外血腦屏障模型證明了Cur-PLA-NO的構建能顯著提高Cur的血腦屏障透過率，為深入研究Cur-PLA-NO的體內生物性能奠定了基礎。