verubulin衍生物的設計合成及活性評價

楊善鵬, 任童童，王 明, 尹東鋒, 王曉鋒*

1.新疆軍區總醫院藥劑科，烏魯木齊 830000；2.新疆醫科大學第五附屬醫院，烏魯木齊 830011

verubulin(MPC-6827，Azixa，EP128495，化合物1，見圖1)化學名稱為N-甲基-2-甲基-4-甲氧基苯胺基喹唑啉，是一種作用于微管蛋白上秋水仙堿結合位點的新型微管聚集抑制劑，通過抑制微管的形成，使腫瘤細胞生長停滯在G2/M期并誘發凋亡，體外對多種腫瘤細胞表現出良好的增殖抑制活性[1-6]。化合物2(見圖1)為1的結構衍生物，在體外也表現出良好的生物活性，尤其是解析了2與微管蛋白的復合晶體結構(PDB編碼：6BR1)，為該類化合物的進一步結構修飾奠定了基礎[7]。化合物3(見圖1)是DOHLE等[8]報道的另一類作用于秋水仙堿結合位點的新型微管聚集抑制劑，同時也解析了其與微管蛋白的復合晶體結構(PDB編碼：5OSK)。通過將6BR1和5OSK進行疊合，并對復合晶體結構中配體構象及與微管蛋白相互作用方式進行分析，我們設想在1的結構中引入類似3中氨基磺酸酯基的基團，由此設計了化合物4a和4b。見圖1，對其分別進行了分子對接、化學合成和體外活性評價。

1 儀器與材料

1.1 儀器

磁力攪拌器(德國IKA公司)；RY-Ⅰ型熔點儀(天津市天分分析儀器廠)；JNM-ECA-400型超導核磁共振儀(日本電子株式會社)；Xevo G2-XS QTOF高分辨質譜儀(沃特世公司)；分子模擬軟件Discovery Studio 3.0(Accelrys，San Diego，USA)。

1.2 試藥

2-甲基-4-氯喹唑啉(質量分數為98%)，3-硝基-4-甲氧基苯胺(質量分數為98%)，3-芐氧基-4-甲氧基苯胺(質量分數為98%)，碘甲烷(質量分數為99%)，氫化鈉(分散在礦物油中，含量為60%)，鈀碳(10% Pd, 還原型, 含水約55%)，氨基磺酰氯(質量分數為97%)，二異丙基乙基胺(質量分數為99.5%)，均購自上海泰坦科技有限公司；無水硫酸鈉，氯化鈉，N,N-二甲基乙酰胺，四氫呋喃，異丙醇，乙酸乙酯，石油醚，乙醚，硅藻土均為分析純，均購自新疆安譜實驗器材有限公司；GF254硅膠板和柱層析硅膠(200目)，購自青島海洋化工有限公司。

圖1 化合物1～4的結構

1.3 細胞株

人乳腺癌細胞MCF-7購自南京凱基生物科技發展有限公司。

2 方法與結果

2.1 4a和4b的計算機輔助設計

本文所選用的復合晶體結構數據均來源于Protein Data Bank(www.rcsb.org)，編號分別為5OSK和6BR1。蛋白結構準備和分子對接所使用的軟件為Discovery Studio 3.0(DS3.0)。

2.1.1蛋白結構5OSK和6BR1的準備和疊合 蛋白結構5OSK和6BR1的預處理[9]：保留晶體結構中1個α、β二聚體及配體小分子和金屬離子，并保留5OSK中的水分子615和6BR1中的水分子675，將其余部分刪除;利用Prepare Protein模塊進行了蛋白結構準備，程序設置中除保留水分子外，其余默認;利用Molecular Overlay模塊對準備好的蛋白進行一致性疊合，立體因素和靜電因素各按50%概率計算。

疊合發現，二者相似度為0.895，2和3中B環上的甲氧基幾近重合，而3中的氨基磺酸酯基誘導氨基酸殘基βN349、βK352向其靠近并分別與之形成氫鍵，顯示出額外的相互作用見圖2，提示在1中引入類似基團可能會增加其與微管蛋白的相互作用，由此設計了4a和4b，并進行了分子對接。

2.1.24a和4b與蛋白結構5OSK的分子對接 以2.1.1中準備好的5OSK為目標對接蛋白，結合位點是以3為中心、10 ?為半徑的球形區域。配體小分子利用Full Minimization模塊進行了能量最小化，并添加了Chemistry at Harvard Macromolecular Mechamics(CHARMM)力場。對接利用CDOCKER模塊進行，參數按程序默認設置，主要包括隨機構象產生、構象優化和模擬退火等。對接結果采用Generalized Born with Molecular Volume(GBMV)溶劑模型計算結合能[9-10]。

注：6BR1和5OSK結構中的氨基酸殘基分別用灰色、青色線狀圖表示，化合物2、3分別用灰色、青色棍狀圖表示。

首先使用3對對接方法進行了驗證，結果顯示最優構象與蛋白結構中配體構象的走向基本一致，RMSD值為0.746 ?，結合能為-44.03 kcal·mol-1，提示對接方法效果較好。4a和4b的對接結果提示其與微管蛋白也有較好的結合，結合能分別為-39.08、-33.33 kcal·mol-1。其中4a的結合能更低，新引入的氨基磺酰胺基與原配體中的氨基磺酸酯基走向較為一致，分別與氨基酸殘基βN349形成1根氫鍵、與βK352形成2根氫鍵，但未像3可另外與αV181、βN349及作為氫鍵傳遞的水分子615形成氫鍵。見圖3。

注：氨基酸殘基用淺灰色線狀圖表示；化合物3和4a分別用青色和橙色棍狀圖表示；氫鍵用綠色虛線表示，氫鍵的距離<3 ?。

2.2 化學合成

2.2.1化合物的合成及表征 以5和6為原料，通過4步反應合成了目標化合物4。合成路線見圖4。

2.2.1.1化合物7a的合成 室溫下，將2-甲基-4-氯喹唑啉(5，179 mg，1 mmol)和3-硝基-4-甲氧基苯胺(6a，168 mg，1 mmol)溶于5 mL異丙醇中，加入1滴濃鹽酸，然后升溫至50 ℃攪拌12 h[11]。冷卻至室溫，析出固體物，抽濾，用5 mL預先冷至4 ℃的異丙醇洗，真空干燥，得到土黃色固體258 mg，即化合物7a。收率：83%；熔點：246～248 ℃；1H NMR(400 MHz,d-DMSO)δ(ppm)9.91(s, 1H)，8.60(d,J=2.4 Hz,1H)，8.48(d,J=8.0 Hz,1H)，8.22(dd,J=9.1, 2.6 Hz, 1H)，7.82(dd,J=11.0, 4.0 Hz,1H)，7.71(d,J=8.2 Hz, 1H)，7.58(dd,J=11.2, 4.0 Hz,1H)，7.43(d,J=9.2 Hz, 1H)，3.94(s, 3H)，2.53(s, 3H)；HR-ESI-MS m/z 311.114 1 [M+H]+(計算值311.113 9, C16H14N4O3)。

2.2.1.2化合物7b的合成 室溫下，將2-甲基-4-氯喹唑啉(5，178 mg，1 mmol)和3-芐氧基-4-甲氧基苯胺(6b，229 mg，1 mmol)溶于5 mL異丙醇中，加入1滴濃鹽酸，然后升溫至50 ℃攪拌12 h。將反應液倒入50 mL冰水中，調pH值至7，析出固體物，抽濾，干燥，得到黃色固體324 mg，即化合物7b。收率：87%；熔點：233～235 ℃；1H NMR(400 MHz,d-DMSO) δ(ppm)11.37(brs, 1H)，8.78(d,J=9.2 Hz, 1H)，8.06(t,J=7.6 Hz, 1H)，7.88(d,J=8.0 Hz, 1H)，7.81(t,J=8.0 Hz,1H)，7.54(d,J=2.0 Hz, 1H)，7.47(d,J=7.1 Hz, 2H)，7.41(t,J=7.4 Hz, 2H)，7.36(d,J=7.1 Hz, 1H)，7.31(dd,J=8.7,2.2 Hz,1H)，7.09(d,J=8.7 Hz, 1H)，5.11(s, 2H)，3.83(s, 3H)，2.59(s,3H)；HR-ESI-MS m/z 372.1711[M+H]+(計算值372.170 7,C23H21N3O2)。

注：試劑及條件：a.cHCl, i-PrOH,50 ℃,12 h; b.CH3I, NaH (60% in oil),THF, 0 ℃～rt, 2 h; c.i.Pd/C,H2, AcOEt, rt, 12 h; ii. ClSO2NH2, DIPEA (for 4a), DMAc, 0 ℃～rt, 24 h。

2.2.1.3化合物8a的合成 室溫下，將2-甲基-4-(3-硝基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(7a，156 mg，0.5 mmol)溶于5 mL無水四氫呋喃中，冰浴冷卻至0 ℃后加入氫化鈉(61 mg, 分散在礦物油中，含量為60%，1.5 mmol)，攪拌5 min后，加入碘甲烷(143 mg，1 mmol)，繼續在該溫度下攪拌30 min后，升溫至室溫反應2 h。將反應物倒入50 mL冰水中，析出固體物，抽濾，干燥。粗品經柱色譜分離(乙酸乙酯∶石油醚=1∶1)，得到土黃色固體135 mg，即化合物8a。收率：83%；熔點：98～201 ℃；1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ(ppm)7.83(d,J=8.4 Hz,1H), 7.75(d,J=2.8 Hz, 1H), 7.64～7.57(m,1H),7.23(dd,J=9.2, 2.8 Hz, 1H), 7.08～7.09(m,J=4.7,2H),7.03(d,J=8.8 Hz, 1H),3.98(s, 3H),3.62(s, 3H),2.76(s,3H)；HR-ESI-MS m/z 325.130 2[M+H]+(計算值325.129 5, C17H16N4O3)。

2.2.1.4化合物8b的合成 室溫下，將2-甲基-4-(3-芐氧基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(7b，188 mg，0.5 mmol)溶于5 mL無水四氫呋喃中，冰浴冷卻至0 ℃后加入氫化鈉(63 mg，分散在礦物油中，含量為60%，1.6 mmol)，攪拌5 min后，加入碘甲烷(145 mg，1.0 mmol)，繼續在該溫度下攪拌30 min后，升溫至室溫反應2 h。將反應物倒入50 mL冰水中，析出固體物，抽濾，干燥。粗品經柱色譜分離(乙酸乙酯∶石油醚=1∶2)，得到白色固體176 mg，即化合物8b。收率：91%；熔點：136～138℃；1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ(ppm)7.78(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.57～7.50(m, 1H), 7.39～7.22(m, 5H), 6.91～6.93(m, 2H), 6.86(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.71～6.75(m, 2H), 5.06(s, 2H), 3.92(s, 3H), 3.55(s, 3H), 2.73(s, 3H)；HR-ESI-MS m/z 386.186 8[M+H]+(計算值 386.186 3,C24H23N3O2)。

2.2.1.5化合物4a的合成 室溫下，將N-甲基2-甲基-4-(3-硝基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(8a，98 mg，0.3 mmol)溶于15 mL乙酸乙酯中，在氫氣氛下加入鈀碳(40 mg，10%)，攪拌反應12 h。通過硅藻土濾除鈀碳，濾液減壓蒸干得到固體，即N-甲基-2-甲基-4-(3-氨基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉。室溫下，取上述固體(85 mg，0.29 mmol)溶于3 mLN,N-二甲基乙酰胺中，冰浴冷卻至0 ℃，依次加入二異丙基乙基胺(101 μL，0.58 mmol)和氨基磺酰氯(67 mg，0.58 mmol)，在該溫度下攪拌30 min后，升溫至室溫反應24 h。將反應液倒入40 mL冰水中，用乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并有機相，用飽和氯化鈉溶液洗，加入無水硫酸鈉干燥過夜，減壓除去乙酸乙酯，向其中加入10 mL乙醚，劇烈攪拌10 min，傾沘出乙醚后，得到黃色固體物61 mg，即化合物4a[12]。收率：54 %；熔點：199～201 ℃；1H NMR(400 MHz,d-DMSO) δ(ppm)8.28(s, 1H), 7.64(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.62～7.54(m, 1H), 7.36(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.22(s, 2H), 7.02～7.09(m, 2H), 6.98(d,J=8.8 Hz, 1H), 6.79(dd,J=8.8, 2.4 Hz, 1H), 3.82(s, 3H), 3.51(s, 3H), 2.59(s, 3H)；HR-ESI-MS m/z 374.128 8[M+H]+(計算值 374.128 1, C17H19N5O3S)。

2.2.1.6化合物4b的合成 室溫下，將N-甲基2-甲基-4-(3-芐氧基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉(8b，135 mg，0.35 mmol)溶于20 mL乙酸乙酯中，然后在氫氣氛下加入鈀碳(105 mg，10%)，攪拌反應12 h。通過硅藻土濾除鈀碳，濾液減壓蒸干得到固體，即N-甲基-2-甲基-4-(3-羥基-4-甲氧基)苯胺基喹唑啉。室溫下，取上述固體(104 mg，0.35 mmol)溶于4 mLN,N-二甲基乙酰胺中，加入氨基磺酰氯(122 mg，1.05 mmol)，攪拌，反應24 h。將反應液倒入40 mL冰水中，用乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并有機相，用飽和氯化鈉溶液洗，加入無水硫酸鈉干燥過夜，減壓除去乙酸乙酯，向其中加入10 mL乙醚，劇烈攪拌10 min，傾沘出乙醚后，得到白色固體物73 mg，即化合物4b[8]。收率：56%；熔點：183～185℃；1H NMR(400 MHz,d-DMSO) δ(ppm)8.00(s, 2H), 7.74～7.55(m, 2H), 7.23(d,J=2.8 Hz, 1H), 7.09～7.18(m, 3H), 7.03(d,J=8.4 Hz, 1H), 3.82(s, 3H), 3.52(s, 3H), 2.60(s, 3H)；HR-ESI-MS m/z 375.112 8 [M+H]+(計算值 375.112 2, C17H18N4O4S)。

2.3 體外MCF-7腫瘤細胞增殖抑制活性篩選

取處于對數生長期的人乳腺癌MCF-7細胞接種于96孔板中，密度為1×104cells·孔-1，每孔加入100 μL細胞懸液，空白組不加細胞培養基，四周邊孔中加入PBS防止邊緣效應。37 ℃下培養24 h后棄去上清液，空白組和對照組各加入100 μL不含藥物的培養基，實驗組分別加入質量濃度100 μg·mL-1倍比濃度梯度稀釋的100 μL含陽性藥、4a和4b的培養基，每組設定5個復孔。繼續培養48 h后，棄去上清液，每孔加入10 μL的CCK8溶液，培養4 h后，除去上清液，用酶標儀測定492 nm處的吸光度值，計算細胞生長抑制率。根據藥物濃度與抑制率作圖，計算GI50值，實驗平行3次[13-16]。陽性藥為1。

經測定，4a和4b均有較好的體外腫瘤細胞增殖抑制活性，其中4a的活性略強于4b，但均較1有所降低，見表1。

2.4 體外微管蛋白聚集抑制活性篩選

利用循環離心法制備的豬腦微管蛋白進行活性測試[17-18]。將不同濃度的藥物與微管蛋白孵化后，在冰浴下加入GDP，然后轉移到0 ℃的比色杯中，隨后升溫至37 ℃，測定該過程中340 nm下的吸光度值。與對照組比較，計算出不同藥物濃度下的抑制率。然后根據藥物濃度與抑制率作圖，計算IC50值，實驗平行2次。陽性藥為CA-4。

經實驗測定，4a和4b都表現出了一定的微管聚集抑制活性，其中4a的活性是4b的6倍多，但顯著低于1和CA-4，見表1。

表1 4a、4b抑制MCF-7細胞增殖的GI50值、抑制微管聚集的IC50值和ClgP值

3 討論

本實驗通過將2、3與微管蛋白的復合晶體結構進行疊合，利用“拼合”策略設計了1的結構衍生物4a和4b，并通過親核取代、甲基化、還原和磺酰化4步反應對目標化合物進行了合成，總收率分別為37%、44%，目標化合物及中間體結構經1H-NMR和HR-ESI-MS確證。

在MCF-7細胞增殖抑制活性評價中，4a和4b顯示出較強的活性，僅略弱于1，達到了次納摩爾水平。但是，在微管聚集抑制實驗中，4a和4b均未顯示出預期的活性，尤其是4b僅表現出非常弱的微管聚集抑制活性。分析靶標活性和細胞活性不一致的可能原因[19]：一是新引入的基團可能改變了化合物與微管蛋白的結合方式，降低了與微管蛋白的親和力，從而導致微管聚集抑制活性下降，但是仍不能排除化合物作用于微管蛋白后會導致的其他效應；二是化合物可能作用于其他未知靶標，需要進行細胞周期阻滯、腫瘤信號通路阻滯方面的研究。4a和4b表現出較好的腫瘤細胞增殖抑制活性，可能與化合物類藥性改變有關。文獻報道的1及其衍生物多表現出脂溶性較強的特點[5]，通過在結構中引入新的基團，降低了化合物的脂溶性使lgP值位于“理想”區間(見表1)[20]，促使化合物更易進入細胞或在細胞中積聚。

總之，本研究在1的結構中引入氨基磺酰基或氨基磺酸酯基，盡管會降低化合物的微管聚集抑制活性，但是腫瘤細胞增殖抑制活性得到基本保持，并改善了類藥性，可為相關微管聚集抑制劑的結構修飾提供借鑒。