直腸癌患者血清miR-144-5p、miR-876-5p表達變化及其與臨床病理特征和預后的關系

湯娜娜，張海玲，蔣波，王曉松，王曉燕

宿遷市第一人民醫院消化內科，江蘇宿遷 223800

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一。據統計，2020年我國結直腸癌新發病例約55.5 萬例，正以每年7.4%的速度快速攀升［1］。近年來，隨著腫瘤篩查項目不斷推廣，越來越多結直腸癌患者得以被早發現、早治療。因此，我國結直腸癌的死亡率已有所下降，但仍遠高于歐美發達國家［2］。迄今為止，結直腸癌的發病機制尚未完全闡明，故深入探索結直腸癌發病的分子機制，對早期篩查和研發靶向藥物具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一種內源性非編碼小RNA 分子，能夠在翻譯水平上調控多種基因的表達，不僅參與細胞增殖、分化、凋亡等生命活動，還參與腫瘤的發生、發展［3］。miR-144-5p、miR-876-5p 是新近發現的miRNA 家族成員。有研究報道，miR-144-5p在胃癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中異常表達［4-5］，miR-876-5p 在膀胱癌、肝癌等惡性腫瘤中異常表達［6-7］。提示miR-144-5p、miR-876-5p 能夠參與多種惡性腫瘤的發生、發展。近年研究發現，在結腸癌細胞中miR-144-5p、miR-876-5p異常表達，其異常表達能夠促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移［8-9］。但鮮有二者表達與直腸癌患者臨床病理特征和預后關系的報道。本研究探討了直腸癌患者血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達變化及其與臨床病理特征和預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月—2019年8月宿遷市第一人民醫院收治的直腸癌患者85 例（觀察組）。直腸癌診斷依據《中國結直腸癌診療規范（2015 版）》［10］，并經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合直腸癌診斷標準；②初診，入院前未接受任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料和術后隨訪資料完整。排除標準：①合并克羅恩病、潰瘍性結腸炎等其他腸道疾病者；②合并其他部位惡性腫瘤者；③年齡＜18 歲者；④合并全身感染性疾病、自身免疫性疾病者；⑤院內死亡者；⑥妊娠期或哺乳期婦女。其中，男48 例、女37 例，年齡44～82（60.18 ±6.15）歲；腫瘤最大徑：≥4 cm 42 例，＜4 cm 43 例；組織分化程度：低分化42 例，中高分化43 例；浸潤深度：T1、T232 例，T3、T453 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期37例，Ⅲ、Ⅳ期48 例；有淋巴結轉移43 例，無淋巴結轉移42 例。同期另選在宿遷市第一人民醫院體檢健康的志愿者52 例（對照組），男29 例、女23 例，年齡27～78（60.52 ± 5.32）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經宿遷市第一人民醫院倫理委員會批準（審批編號：2019-124），所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達檢測 觀察組入院次日、對照組體檢當日，采集清晨空腹外周靜脈血3 mL，1 500×g 離心15 min，留取上層血清。采用TRIzol 法提取血清總RNA，經超微量分光光度計鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格。按TaKaRa逆轉錄試劑盒說明將總RNA 逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA 為模板，按SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒說明進行PCR 擴增。所有引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司設計合成。miR-144-5p 上游引物5′-CTACGCTCCGT?GAGATGTGCT-3′、下游引物5′-TAGCACTCAGTAT?GATAACTA-3′，內參U6 上游引物5′-CTCGCTTCG?GCACACA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATT?GCGT-3′；miR-876-5p 上游引物5′-TGAAGTGCTGT?GGATTTCTTTGTG-3′、下游引物5′-TGAATTACTTT?GTAAACCACCACCA-3′，內參U6 上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′、下游引物5′-GT?GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。PCR 反應體系共20.0 μL：SYBR?Premix Ex Taq 10.0 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2.0 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase Free H2O 6.0 μL；反應條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s共40個循環。PCR擴增反應結束，繪制熔解曲線，收集循環閾值（CT）數。以U6 為內參，采用2-ΔΔCT法計算血清miR-144-5p、miR-876-5p相對表達量。

1.3 隨訪 直腸癌患者術后通過門診復查或電話形式定期隨訪3年，隨訪截至2022年8月，統計患者死亡情況，計算3年生存率。

1.4 統計學方法 采用SPSS28.0 統計軟件。正態分布的計量資料以±s表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。預測效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線，曲線下面積（AUC）比較采用Hanley & McNeil 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-144-5p、miR-876-5p表達比較 觀察組血清miR-144-5p、miR-876-5p相對表達量分別為1.10 ± 0.22、1.45 ± 0.44，對照組分別為1.84 ±0.42、2.12 ± 0.31。觀察組血清miR-144-5p、miR-876-5p 相對表達量均顯著低于對照組（t分別為11.786、10.504，P均＜0.05）。

2.2 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達與直腸癌患者臨床病理特征的關系 見表1。

表1 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達與直腸癌患者臨床病理特征的關系

2.3 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達與直腸癌患者預后的關系 85 例直腸癌患者共隨訪5～36 個月，至隨訪截至日期，死亡20 例，3年生存率為76.47%（65/85）。以血清miR-144-5p、miR-876-5p表達的平均值為界，將直腸癌患者分為miR-144-5p高表達者（miR-144-5p 相對表達量≥1.10）43 例與miR-144-5p 低表達者（miR-144-5p 相對表達量＜1.10）42 例、miR-876-5p 高表達者（miR-876-5p 相對表達量≥1.45）46 例與miR-876-5p 低表達者（miR-876-5p 相對表達量＜1.45）39 例。miR-144-5p 高表達者3年生存率為88.37%（38/43），miR-144-5p 低表達者為64.29%（27/42），miR-144-5p 高表達者3年生存率顯著高于miR-144-5p低表達者（χ2=4.368，P＜0.05）；miR-876-5p 高表達者3年生存率為86.96%（40/46），miR-876-5p 低表達者為64.10%（25/39），miR-876-5p 高表達者3年生存率顯著高于miR-876-5p低表達者（χ2=4.286，P＜0.05）。

2.4 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達對直腸癌患者預后不良的預測價值 ROC 曲線分析顯示，血清miR-144-5p 表達預測直腸癌患者預后不良的AUC為0.781（95%CI：0.678～0.864），最佳截斷值為1.19，此時其預測直腸癌患者預后不良的靈敏度為95.00%、特異度為46.15%；血清miR-876-5p表達預測直腸癌患者預后不良的AUC為0.795（95%CI：0.694～0.875），最佳截斷值為1.51，此時其預測直腸癌患者預后不良的靈敏度為95.00%、特異度為56.92%；血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達聯合預測直腸癌患者預后不良的AUC為0.888（95%CI：0.801～0.946），其預測直腸癌患者預后不良的靈敏度為90.00%、特異度為78.46%。血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達聯合預測直腸癌患者預后不良的AUC顯著高于血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達單獨（Z分別為2.320、2.247，P均＜0.05）。見圖1。

圖1 血清miR-144-5p、miR-876-5p表達預測直腸癌患者預后不良的ROC曲線

3 討論

直腸癌是一種起源于直腸黏膜上皮的惡性腫瘤。近年來，隨著人口老齡化加劇和飲食結構改變，我國直腸癌的發病率和死亡率一直居高不下［1］。盡早發現并及時處理癌前病變和癌前狀態是降低直腸癌患者死亡率的關鍵。但由于直腸癌早期無特異性癥狀，大多數患者出現典型癥狀就診時已進展至中晚期，盡管近年來放化療、免疫治療、靶向治療等取得了重大進展，但中晚期直腸癌極易發生局部擴散和遠處轉移，即使經積極治療，預后仍然較差［2］。迄今為止，直腸癌的發病機制尚未完全闡明。因此，深入探索直腸癌發病的分子機制，對其早期篩查和研發靶向藥物具有重要意義。

目前，臨床主要通過血清甲胎蛋白、癌胚抗原、糖類抗原19-9 等腫瘤標志物評估直腸癌患者預后，但其靈敏度和特異度較低。在腫瘤發生、發展過程中涉及一系列表觀遺傳學改變，而非編碼RNA 在表觀遺傳學調控中發揮重要作用。miRNA 作為一種內源性非編碼小RNA 分子，能夠通過與mRNA 的3′端非編碼區特定位點結合，與mRNA 完美配對或不完美配對引起mRNA 降解或轉錄后基因沉默，從而參與腫瘤的發生、發展［3］。miR-144-5p 定位于人17號染色體長臂11.2 處。最初發現miR-144-5p 可參與貧血過程，近年發現miR-144-5p 還參與腫瘤的發生、發展。有研究報道，miR-144-5p在非小細胞肺癌中低表達，通過靶向細胞周期蛋白依賴性激酶1 抑制非小細胞肺癌細胞增殖和細胞周期分布［11］；miR-144-5p 在卵巢癌中低表達，通過靶向La 相關蛋白1抑制卵巢癌細胞上皮間質轉化［12］。HAN 等［13］通過miRNA 微陣列分析發現，miR-144-5p 在奧沙利鉑化療抵抗的結直腸癌患者外周血中表達降低。但目前鮮有直腸癌患者外周血miR-144-5p 表達變化的報道。本研究結果顯示，觀察組血清miR-144-5p 表達顯著低于對照組；血清miR-144-5p 表達與直腸癌浸潤深度、TNM 分期和淋巴結轉移有關，而與性別、年齡、腫瘤最大徑、組織分化程度無關。結果表明，miR-144-5p能夠參與直腸癌的發生、發展，其機制可能與miR-144-5p表達下調能夠上調環指蛋白187表達有關。環指蛋白187 是含RING 域的E3 泛素連接酶，能夠通過與底物偶聯作用促進結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移［14］。

miR-876-5p 定位于人9 號染色體短臂21.1 處。近年研究發現，miR-876-5p 能夠參與多種惡性腫瘤的發生、發展。有研究報道，miR-876-5p在髓母細胞瘤中低表達，并通過靶向叉頭盒蛋白M1 抑制髓母細胞瘤細胞增殖和侵襲［15］；miR-876-5p 在卵巢癌細胞中高表達，并通過靶向F-box 蛋白31 促進卵巢癌細胞生長和侵襲［16］。這些研究表明miR-876-5p 在不同腫瘤中發揮的作用不同。本研究結果顯示，觀察組血清miR-876-5p 表達顯著低于對照組；血清miR-876-5p 表達與直腸癌浸潤深度、TNM 分期和淋巴結轉移有關，而與性別、年齡、腫瘤最大徑、組織分化程度無關。結果表明，miR-876-5p 亦參與直腸癌的發生、發展，其機制可能與miR-876-5p 表達下調能夠導致Ras 蛋白激活劑樣2 表達上調有關。Ras蛋白激活劑樣2 是一種GTP 結合蛋白，可通過抑制促進Yes 相關蛋白去磷酸化激活的Yes 相關蛋白信號通路，促進結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移［17］。

本研究結果發現，miR-144-5p、miR-876-5p 高表達者3年生存率均顯著高于其低表達者。表明血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達與直腸癌患者預后密切相關，有望成為評估直腸癌患者預后的潛在生物標志物。本研究ROC曲線分析發現，血清miR-144-5p、miR-876-5p 表達預測直腸癌患者預后不良的AUC分別為0.781、0.795，提示血清miR-144-5p、miR-876-5p表達對直腸癌患者預后不良均具有一定預測價值；血清miR-144-5p、miR-876-5p表達聯合預測直腸癌患者預后不良的AUC為0.888，高于血清miR-144-5p、miR-876-5p表達單獨，提示血清miR-144-5p、miR-876-5p表達聯合能夠提高對直腸癌患者預后不良的預測價值。

綜上所述，直腸癌患者血清miR-144-5p、miR-876-5p 低表達，二者表達與腫瘤浸潤深度、TNM 分期、淋巴結轉移以及患者預后密切相關，并可作為預測直腸癌患者預后不良的生物標志物。