鹽酸青藤堿對DSS誘導潰瘍性結腸炎小鼠腸道炎癥損傷的影響及其機制

謝小榮，呂曉丹，范俊華，李世權，詹靈凌，呂小平

1 廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科，南寧 530021；2 廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科

潰瘍性結腸炎是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，近年來其發病率在全球范圍內呈明顯上升趨勢［1］。潰瘍性結腸炎的發病機制尚不完全清楚，可能是遺傳、環境、免疫等因素共同作用的結果。自噬是細胞自我分解代謝的一種方式，可通過降解體內異常蛋白質及衰老或受損細胞器等維持細胞內環境穩定，還可通過調節腸上皮細胞連接、參與病原體清除、調控炎癥信號表達等途徑介導腸黏膜屏障損傷［2-3］。因此，自噬有可能成為研究潰瘍性結腸炎的一個重要方向。青藤堿是從中藥青風藤中提取的一種生物堿，具有抗炎、鎮痛、免疫抑制等藥理作用。鹽酸青藤堿（SIN）是青藤堿的藥用形式，對結腸炎具有較好的治療效果［4］。但目前SIN 治療結腸炎的機制尚不明確。2021年11月—2022年9月，本研究探討了SIN 對DSS 誘導潰瘍性結腸炎小鼠腸道炎癥損傷的影響及其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性C57BL/6J小鼠18只，SPF級，體質量（20 ± 2）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，使用許可證編號：SCXK 桂2020-0003。所有小鼠分籠飼養，每籠6 只，自由攝食和飲水。飼養環境：溫度24 ℃、相對濕度60%、12 h/12 h 明暗交替。研究設計與實施過程符合動物福利和倫理原則（審查編號：202107006）。SIN，純度98%，購自上海麥克林生化科技有限公司；DSS，購自大連美侖生物技術有限公司。小鼠TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA 試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；通用型免疫組化試劑盒，購自北京中衫金橋生物技術有限公司。兔源Beclin1、LC3B 單克隆抗體，購自艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司；兔源p62多克隆抗體，購自沈陽萬類生物科技有限公司；HRP 標記的山羊抗小鼠/兔IgG二抗，購自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.2 模型構建與藥物干預 所有小鼠適應性飼養1周，隨機分為對照組、模型組、SIN組，每組6只。模型組予3% DSS溶液自由飲用7 d誘導結腸炎，當小鼠出現毛發粗糙、活動和攝食減少、體質量進行性下降，并伴有腹瀉、肉眼血便等，表明成功誘導出結腸炎。SIN組予3% DSS溶液自由飲用同時予100 mg/（kg·d） SIN溶液灌胃，連續7 d。對照組與模型組同期予等體積生理鹽水灌胃。

1.3 疾病活動指數（DAI）評分評估 建模期間，觀察糞便性狀，并對新鮮糞便進行糞便隱血試驗（干化學法），建模第8 天評估DAI 評分［5］。體質量改變評分：體質量下降≤1%，計0分；體質量下降＞1%～5%，計1分；體質量下降＞5%～10%，計2分；體質量下降＞10%～15%，計3分；體質量下降＞15%，計4分。糞便隱血試驗評分：陰性，計0 分；弱陽性，計1 分；陽性，計2分；強陽性，計3分；肉眼血便，計4分。大便性狀評分：正常，計0分；松散，計1分；半稀便，計2分；稀便，計3分；水樣便，計4分。DAI評分=（體質量改變評分 + 糞便隱血試驗評分 + 大便性狀評分）/3。

1.4 結腸長度測量及組織學損傷評分評估 建模結束，處死小鼠，剪取結腸組織，測量肛門至回盲部結腸長度。縱向剖開結腸，取炎癥明顯處結腸組織0.5 cm，10%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，4 μm 厚連續切片。切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、氨水反藍、伊紅染色，然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。將已染色烘干的切片在光學顯微鏡下拍照觀察，隨機選取5 個不重疊的高倍鏡視野（200×），評估組織學損傷評分［6］。炎癥程度評分：無炎癥，上皮未見中性粒細胞浸潤，計0分；輕度炎癥，隱窩或上皮中性粒細胞浸潤≤50%，無糜爛或潰瘍，計1 分；中度炎癥，隱窩或上皮中性粒細胞浸潤＞50%，無糜爛或潰瘍，計2 分；重度炎癥，可見糜爛或潰瘍，計3 分。病變深度評分：無，計0 分；僅限于黏膜層，計1分；至黏膜下層，計2分；至肌層，計3 分；至漿膜層，計4 分。隱窩損傷評分：無，計0分；基底部1/3隱窩破壞，計1分；基底部2/3隱窩破壞，計2 分；僅表面上皮完整，計3 分；全部隱窩和上皮破壞，計4分。病變范圍評分：≤1%，計0分；＞1%～25%，計1分；＞25%～50%，計2分；＞50%～75%，計3分；＞75%，計4分。組織學損傷評分=炎癥程度評分 +病變深度評分 + 隱窩損傷評分 + 病變范圍評分。

1.5 結腸組織TNF-α、IL-6、IL-10 含量檢測 取結腸組織30 mg，用組織剪剪碎，經超聲破碎制成組織勻漿，4 ℃下5 000×g 離心5 min，留取上清液，采用ELISA 法檢測TNF-α、IL-6、IL-10 含量。所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.6 結腸組織自噬相關蛋白Beclin1、LC3B、p62 表達檢測 取石蠟包埋的結腸組織，4 μm 厚連續切片。將切片置于60 ℃烤箱烘烤1 h，然后經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，在檸檬酸鈉抗原修復液中高溫高壓修復抗原，自然冷卻至室溫，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶活性。正常山羊血清封閉后，分別滴加Beclin1、LC3B、p62 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，滴加HRP 標記的山羊抗小鼠/兔IgG 二抗。DAB顯色、蘇木素復染、鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下拍照觀察。Beclin1、LC3B陽性染色主要定位于細胞質，p62陽性染色定位于細胞質及部分細胞核，呈黃色或棕黃色顆粒。每張切片隨機選取5個不重疊的高倍鏡視野（400×），采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對陽性染色進行半定量分析，計算平均光密度（AOD）。AOD=積分光密度/陽性面積。以AOD值代表蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組病理形態學變化及DAI 評分、結腸長度、組織學損傷評分比較 對照組結腸黏膜上皮、腺體及隱窩結構無破壞，未見炎癥細胞浸潤；與對照組相比，模型組結腸黏膜結構受損嚴重，腺體及隱窩結構消失，可見大量炎癥細胞浸潤至黏膜下層；與模型組相比，SIN 組結腸黏膜結構損傷明顯減輕，可見部分腺體及隱窩結構破壞，黏膜下層浸潤的炎癥細胞數量明顯減少。各組DAI評分、結腸長度、組織學損傷評分比較見表1。

表1 各組DAI評分、結腸長度、組織學損傷評分比較（±s）

表1 各組DAI評分、結腸長度、組織學損傷評分比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組SIN組組織學損傷評分（分）0.00 ± 0.00 12.83 ± 0.75*9.33 ± 1.37*#n6 6 6 DAI評分（分）0.00 ± 0.00 3.84 ± 0.18*2.95 ± 0.49*#結腸長度（cm）8.05 ± 0.35 5.33 ± 0.31*6.50 ± 0.51*#

2.2 各組結腸組織TNF-α、IL-6、IL-10含量比較 見表2。

表2 各組結腸組織TNF-α、IL-6、IL-10含量比較（ng/mL，±s）

表2 各組結腸組織TNF-α、IL-6、IL-10含量比較（ng/mL，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組SIN組IL-10 9.69 ± 1.72 2.00 ± 0.42*4.38 ± 0.85*#n6 6 6 TNF-α 0.28 ± 0.13 0.66 ± 0.17*0.39 ± 0.03#IL-6 0.02 ± 0.01 0.05 ± 0.02*0.03 ± 0.00*#

2.3 各組結腸組織自噬相關蛋白Beclin1、LC3B、p62表達比較 見表3。

表3 各組結腸組織自噬相關蛋白Beclin1、LC3B、p62相對表達量比較（±s）

表3 各組結腸組織自噬相關蛋白Beclin1、LC3B、p62相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對照組模型組SIN組p62 0.03 ± 0.01 0.09 ± 0.01*0.05 ± 0.01*#n6 6 6 Beclin1 0.05 ± 0.01 0.02 ± 0.00*0.04 ± 0.01*#LC3B 0.08 ± 0.02 0.01 ± 0.00*0.04 ± 0.01*#

3 討論

潰瘍性結腸炎是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其發病機制尚不完全清楚。目前，潰瘍性結腸炎的臨床用藥主要包括氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑等，但這些藥物治療效果欠佳、不良反應較多。因此，新藥探索與研發對潰瘍性結腸炎治療具有重要意義。

青藤堿是從中藥青風藤中提取的一種天然生物堿，具有良好的抗炎活性和免疫抑制作用。臨床上以青藤堿為主要成分的藥物制劑主要用于治療風濕病、神經痛等［7］。既往研究報道，青藤堿能夠緩解實驗性結腸炎中過度活躍的炎癥水平，其機制可能與通過抑制TLR/NF-κB 信號通路而減少炎癥因子產生有關［4］。SIN是青藤堿的藥用形式，可通過抗氧化作用減輕結腸組織炎癥損傷［8］。本研究采用3%DSS 溶液誘導小鼠結腸炎，并評估SIN 對結腸炎癥損傷的治療效果。DAI 評分、結腸長度變化和組織學損傷評分是評估潰瘍性結腸炎嚴重程度的重要指標［9］。本研究結果發現，與對照組比較，模型組DAI評分顯著升高，結腸長度顯著縮短，結腸黏膜結構遭到破壞并出現明顯炎癥細胞浸潤，組織學損傷評分顯著升高；與模型組比較，SIN 組DAI 評分有所降低，結腸長度有所延長，結腸黏膜結構破壞、炎癥細胞浸潤有所改善，組織學損傷評分顯著改善。結果提示，SIN 能夠改善潰瘍性結腸炎小鼠結腸炎癥損傷。

促炎癥細胞因子與抗炎癥細胞因子分泌失衡導致的炎癥反應是潰瘍性結腸炎發生、發展的重要環節。TNF-α、IL-6 是介導潰瘍性結腸炎的關鍵促炎癥細胞因子。有研究報道，潰瘍性結腸炎患者血漿TNF-α、IL-6 水平顯著升高，并且其水平與結腸黏膜炎癥程度密切相關［10］。而使用TNF-α、IL-6 抑制劑可控制腸黏膜炎癥，在潰瘍性結腸炎中表現出良好的治療效果。IL-10屬于抗炎癥細胞因子，動物實驗表明，敲除IL-10 基因小鼠可出現自發性結腸炎［11］。因此，機體炎癥細胞因子水平與結腸炎癥密切相關。本研究結果發現，與對照組比較，模型組結腸組織TNF-α、IL-6 含量顯著升高，而IL-10 含量顯著降低；與模型組比較，SIN 組結腸組織TNF-α、IL-6含量顯著降低，而IL-10 含量顯著升高。結果提示，SIN能夠顯著改善促炎癥細胞因子與抗炎癥細胞因子分泌失衡狀態，抑制機體炎癥反應程度。

潰瘍性結腸炎的病理特征是機體免疫系統紊亂而引起的黏膜炎癥反應。自噬是細胞自我分解代謝的一種方式，可通過樹突狀細胞調控抗原呈遞以及巨噬細胞分泌炎癥細胞因子，從而參與體內先天性免疫和適應性免疫調節過程［12］。自噬過程是多種自噬相關蛋白參與的級聯反應，如Beclin1、LC3B、p62等。Beclin1與PI3K形成復合體，該復合體可促進自噬小體膜形成與延伸。LC3B定位于自噬體膜，在自噬體形成過程中，LC3Ⅰ偶聯磷酸酰乙醇胺形成LC3Ⅱ，從而參與自噬體膜延伸與閉合。在整個自噬過程中，LC3B 是動態變化的，并能反映機體自噬水平［13］。p62作為自噬底物可與泛素化蛋白及LC3Ⅱ結合，從而參與自噬體形成，而p62本身與異常蛋白質結合，可進入溶酶體中降解。因此，p62 能夠反映自噬活性［14］。有研究表明，實驗性結腸炎小鼠結腸組織自噬水平顯著降低，促炎癥細胞因子水平顯著升高，而提高自噬通路活化狀態則可降低促炎癥細胞因子水平，進而緩解結腸炎癥狀態［15］。在細胞水平上抑制自噬活性，可增加NF-κB p65 磷酸化，影響促炎癥細胞因子分泌，進而參與炎癥調控［16-17］。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組結腸組織p62相對表達量顯著升高，而Beclin1、LC3B 相對表達量顯著降低；與模型組比較，SIN 組結腸組織p62 相對表達量顯著降低，而Beclin1、LC3B 相對表達量顯著升高。結果提示，SIN 能夠部分解除炎癥所致的自噬抑制狀態。

綜上所述，SIN 可改善DSS 誘導潰瘍性結腸炎小鼠腸道炎癥損傷，其機制可能與SIN 能夠部分解除炎癥所致的自噬抑制狀態有關。