敲低CTCF對5-氟尿嘧啶、順鉑耐藥結直腸癌細胞惡性生物學行為的影響及其機制

王蓉荻，郭旭，徐孟

大連市中心醫院肛腸外科，遼寧大連 116000

結直腸癌（CRC）是消化系統常見的惡性腫瘤之一，其發病率居全球惡性腫瘤第三位，死亡率居全球惡性腫瘤第二位。近年來，隨著人們生活水平提高和生活方式轉變，我國CRC 的發病率逐年升高［1］。CRC 早期癥狀隱匿，缺乏特異性臨床表現，約85%患者就診時已處于中晚期。化療是中晚期CRC 的重要治療手段，常用的化療藥物有5-氟尿嘧啶（5-Fu）、順鉑（DDP）等，但藥物積累可誘導腫瘤細胞中多藥耐藥基因表達，從而導致化療耐藥［2］。化療耐藥是導致CRC 治療失敗的重要原因。CRC 化療耐藥的機制非常復雜，可能與編碼外排泵的基因表達改變、分泌外泌體、血管生成關鍵信號通路激活等有關［3］。CCCTC 結合因子（CTCF）是含有11 個鋅指結構的多功能轉錄因子，盡管長度超過700 個氨基酸，但其高度保守［4］。有研究報道，CTCF 異常表達或其靶基因失調能夠引起多種惡性腫瘤的發生、發展，如乳腺癌、肝細胞癌、CRC 等［5-7］。KATAINEN等［8］研究發現，在CRC 細胞中CTCF 基因突變率較高，該基因突變可能參與CRC 化療耐藥。但目前鮮見相關報道。2020年8月—2022年1月，本研究探討了敲低CTCF 對5-Fu、DDP 耐藥CRC 細胞惡性生物學行為的影響及其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 CRC 耐藥細胞株HT29/5-Fu、HT29/DDP，購自江西江藍純生物試劑有限公司。5-Fu（純度≥99.0%）、DDP（純度≥98.5%），購自北京索萊寶科技有限公司。CTCF 短發夾RNA 質粒（shCTCF）、對照短發夾RNA 質粒（shControl）由廣州艾迪基因科技有限責任公司合成。Multiskan GO 全波長酶標儀，購自美國Thermo Fisher 公司；JY5000 型高壓電泳儀，購自北京君意東方電泳設備有限公司；FACS?Calibur 流式細胞儀，購自美國BD 公司；Transwell 小室，購自美國Corning 公司。Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒，購自江蘇碧云天生物技術有限公司。MTT、結晶紫，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；兔抗鼠CTCF、補綴同源物1（PTCH1）、補綴同源物2（PTCH2）、膠質瘤相關癌基因同源蛋白1（GLI1）、音猬因子（SHH）、β-actin 單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG 二抗，購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 細胞傳代培養 將HT29/5-Fu、HT29/DDP 細胞接種于含10% FBS 的RPMI 1640 培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。每2～3 天換液一次。待細胞生長融合85%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3 傳代。取傳3 代、對數生長期、生長狀態良好的細胞進行后續實驗。

1.3 5-Fu、DDP 最佳作用濃度篩選 取傳3 代、對數生長期、生長狀態良好的HT29/5-Fu 細胞和HT29/DDP 細胞接種于96 孔板，每孔5 × 103個，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養24 h。HT29/5-Fu 細胞分別加入2、4、8、16 mg/L 5-Fu，HT29/DDP 細胞分別加入0.5、1、2、4 mg/L DDP，另設陰性對照孔（不加入5-Fu 或DDP）、空白對照孔（僅有培養基，無HT29/5-Fu 細胞或HT29/DDP 細胞），每個濃度設6 個復孔，繼續培養48 h。然后每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μL，37 ℃孵育2 h。小心吸棄孔內培養上清液，加入DMSO溶液200 μL，輕輕振蕩，使結晶物充分溶解。酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值，按公式計算細胞存活率。細胞存活率=1-［（實驗孔OD450值-空白對照孔OD450值）/（陰性對照孔OD450值-空白對照孔OD450值）］× 100%。選擇HT29/5-Fu、HT29/DDP 細胞半數抑制活性（IC50）時5-Fu 或DDP 濃度進行后續實驗。

1.4 細胞轉染 取傳3 代、對數生長期、生長狀態良好的HT29/5-Fu細胞和HT29/DDP細胞，接種于6孔板，每孔2 × 105個，隨機分為HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl 組、HT29/DDP shCTCF 組與HT29/DDP shControl 組，每組設3 個復孔。然后將6 孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養24 h，根據Lipofectamine?2000 說明，HT29/5-Fu shCTCF 組與HT29/DDP shCTCF 組轉染shCTCF，HT29/5-Fu shControl 組與 HT29/DDP shControl 組轉染shControl。轉染6 h 更換新鮮培養基，繼續培養24 h，收集細胞，用于后續實驗。

1.5 CTCF蛋白表達檢測 取各組上述轉染后細胞4 × 106個，置于離心管中，加入適量的Western 及IP細胞裂解液，提取細胞總蛋白。經BCA 法蛋白定量合格，加入適量5 × SDS-PAGE 凝膠上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE 分離（10%分離膠、5%濃縮膠）。電泳結束，采用濕轉法將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗鼠CTCF、β-actin 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，滴加辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG 二抗，室溫孵育1 h。ECL 發光，暗室內曝光、顯影。采用Amersham Imager 600 凝膠成像系統拍照，Image J 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin 為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.6 細胞存活率檢測 取各組上述轉染后細胞，接種于96 孔板，每孔5 × 103個，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。培養24 h，HT29/5-Fu shCTCF 組與HT29/5-Fu shControl 組分別加入最佳作用濃度的5-Fu，HT29/DDP shCTCF 組與HT29/DDP shControl 組分別加入最佳作用濃度的DDP，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。分別于培養24、48、72 h，每孔加入5 mg/L MTT 溶液20 μL，37 ℃孵育2 h。小心吸棄孔內培養上清液，加入DMSO 溶液200 μL，輕輕振蕩，使結晶物充分溶解。酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔的OD 值，按1.3中公式計算細胞存活率。

1.7 細胞侵襲能力檢測 取各組上述轉染后細胞，用不含血清的培養基重懸，制成密度為2 × 105個/mL細胞懸液。取細胞懸液200 μL，加入Transwell 小室上室，下室加入600 μL含15% FBS的培養基。37 ℃孵育48 h，取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去上室面未穿膜細胞，90%乙醇固定30 min，0.1%結晶紫染色15 min，顯微鏡下拍照。隨機選取5個200倍不重疊視野，計數每視野穿膜細胞數。以穿膜細胞數代表細胞侵襲能力。

1.8 細胞凋亡檢測 取各組上述轉染后細胞，接種于6 孔板，每孔3 × 106個，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養24 h。HT29/5-Fu shCTCF 組與HT29/5-Fu shControl 組分別加入最佳作用濃度的5-Fu，HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl組分別加入最佳作用濃度的DDP，繼續培養48 h。收集細胞，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化，4 ℃下300 × g離心5 min。收集細胞并轉移至1.5 mL EP 管中，加入1 × Binding Buffer 100 μL 重懸細胞，然后依次加入Annexin V-FITC 5 μL、PI Staining Solution 10 μL，輕輕吹打混勻，室溫避光孵育15 min，然后加入1 × Binding Buffer 400 μL 混勻，1 h 內上流式細胞儀檢測。

1.9 Hedgehog 信號通路相關蛋白表達檢測 取各組上述轉染后細胞，接種于6 孔板，每孔5 × 106個，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養24 h。 HT29/5-Fu shCTCF 組與HT29/5-Fu shControl 組分別加入最佳作用濃度的5-Fu，HT29/DDP shCTCF 組與HT29/DDP shControl 組分別加入最佳作用濃度的DDP，繼續培養48 h。收集細胞，采用Western blotting 法檢測Hedgehog 信號通路PTCH1、PTCH2、GLI1、SHH 蛋白表達，具體步驟參照1.5。

1.10 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5-Fu、DDP 最佳作用濃度篩選結果 5-Fu 或DDP 均呈劑量依賴性抑制HT29/5-Fu 細胞或HT29/DDP 細胞增殖（P均＜0.05），見表1。5-Fu 對HT29/5-Fu 細胞IC50的濃度為（13.0 ± 1.6）mg/L，DDP 對HT29/DDP 細胞IC50的濃度為（15.2 ± 1.3）mg/L。因此，選擇13.0 mg/L 5-Fu、15.0 mg/L DDP 進行后續實驗。

表1 不同濃度5-Fu 或DDP 對HT29/5-Fu 細胞或HT29/DDP細胞存活率的影響（%）

2.2 兩組轉染后CTCF 蛋白表達比較 HT29/5-Fu shCTCF 組與HT29/5-Fu shControl 組CTCF 蛋白相對表達量分別為0.32 ± 0.11、0.86 ± 0.08，HT29/5-Fu shCTCF組CTCF蛋白相對表達量顯著低于HT29/5-Fu shControl 組（t=4.421，P＜0.05）；HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl 組CTCF 蛋白相對表達量分別為0.27 ± 0.14、0.93 ± 0.05，HT29/DDP shCTCF 組CTCF 蛋白相對表達量顯著低于HT29/DDP shControl組（t=5.841，P＜0.05）。

2.3 兩組細胞存活率比較 見表2、3。

表2 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl組培養不同時間細胞存活率比較（%，±s）

表2 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl組培養不同時間細胞存活率比較（%，±s）

注：與HT29/5-Fu shControl組同期比較，*P＜0.05。

組別細胞存活率HT29/5-Fu shCTCF組HT29/5-Fu shControl組培養72 h 15.8 ± 2.9*40.1 ± 4.5培養0 h 97.5 ± 1.2 98.2 ± 1.5培養24 h 54.8 ± 3.5*81.6 ± 5.4培養48 h 32.0 ± 3.8*54.2 ± 4.2

表3 HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl組培養不同時間細胞存活率比較（%，±s）

表3 HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl組培養不同時間細胞存活率比較（%，±s）

注：與HT29/DDP shControl組同期比較，*P＜0.05。

組別HT29/DDP shCTCF組HT29/DDP shControl組細胞存活率培養72 h 5.3 ± 2.9*38.4 ± 3.6培養0 h 98.2 ± 1.2 97.6 ± 3.2培養24 h 52.3 ± 3.5*68.9 ± 4.6培養48 h 21.5 ± 3.8*54.3 ± 4.1

2.4 兩組細胞侵襲能力比較 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl 組穿膜細胞數分別為（18.67 ± 4.04）、（36.33 ± 4.52）個，HT29/5-Fu shCTCF組穿膜細胞數顯著低于HT29/5-Fu shControl組（t=5.021，P＜0.01）；HT29/DDP shCTCF 組與HT29/DDP shControl 組穿膜細胞數分別為（15.33 ±3.51）、（44.67 ± 4.34）個，HT29/DDP shCTCF 組穿膜細胞數顯著低于HT29/DDP shControl 組（t=5.632，P＜0.01）。

2.5 兩組細胞凋亡率比較 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl 組細胞凋亡率分別為（77.57 ± 3.00）%、（28.20 ± 3.79）%，HT29/5-Fu shCTCF組細胞凋亡率顯著高于HT29/5-Fu shControl組（t=8.632，P＜0.01）；HT29/DDP shCTCF 組與HT29/DDP shControl組細胞凋亡率分別為（75.87 ±5.78）%、（35.50 ± 2.66）%，HT29/DDP shCTCF 組細胞凋亡率顯著高于HT29/DDP shControl 組（t=6.541，P＜0.01）。

2.6 兩組Hedgehog信號通路相關蛋白表達比較 見表4、5。

表4 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl組Hedgehog信號通路相關蛋白表達比較（±s）

表4 HT29/5-Fu shCTCF組與HT29/5-Fu shControl組Hedgehog信號通路相關蛋白表達比較（±s）

注：與HT29/5-Fu shControl組比較，*P＜0.05。

組別HT29/5-Fu shControl組HT29/5-Fu shCTCF組SHH 0.78 ± 0.04 0.30 ± 0.04*PTCH1 0.84 ± 0.14 0.32 ± 0.05*PTCH2 0.86 ± 0.09 0.21 ± 0.06*GLI1 0.92 ± 0.10 0.26 ± 0.03*

表5 HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl組Hedgehog信號通路相關蛋白表達比較（±s）

表5 HT29/DDP shCTCF組與HT29/DDP shControl組Hedgehog信號通路相關蛋白表達比較（±s）

注：與HT29/DDP shControl組比較，*P＜0.05。

組別HT29/DDP shControl組HT29/DDP shCTCF組SHH 0.84 ± 0.11 0.15 ± 0.04*PTCH1 0.89 ± 0.10 0.14 ± 0.03*PTCH2 0.92 ± 0.11 0.18 ± 0.03 GLI1 0.95 ± 0.12 0.20 ± 0.04*

3 討論

近年來，我國CRC 的發病率不斷上升，發病人群呈年輕化趨勢。CRC 早期癥狀隱匿，缺乏特異性臨床表現，約85%患者就診時已處于中晚期。化療在中晚期CRC 輔助治療中占有重要地位，常用的化療藥物有5-Fu、DDP 等。但部分患者經過一段時間化療后易對5-Fu、DDP 等產生耐藥性，導致化療效果不理想［9］。目前，CRC 化療耐藥的具體機制尚不完全清楚，主要涉及DNA 損傷修復增強、轉運蛋白家族表達和功能異常、腫瘤干細胞特性改變、信號轉導通路異常激活等［10］。因此，深入探索CRC 化療耐藥的機制對提高腫瘤化療敏感性具有重要意義。

CTCF又稱鋅指蛋白，是一種在真核生物中廣泛表達的多功能轉錄因子，能夠參與轉錄調控、染色質結構維護以及蛋白復合物合成等。CTCF 可通過多種機制調控基因的表達，如招募其他共激活因子、結合靶基因啟動子等。有研究報道，CTCF在多種惡性腫瘤中表達上調，其表達上調可促進腫瘤細胞惡性生物學行為［11-12］。ZHAO 等［13］研究顯示，CTCF 在神經母細胞瘤中表達上調，其表達上調可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移。GIANNAKIS 等［14］對619 例CRC 患者進行全外顯子組測序發現，TP53、KRAS、SMAD4、CTCF 等是CRC 中反復突變的基因。提示CTCF 可能在CRC 的發生、發展中發揮重要作用。LAI 等［15］研究發現，CTCF 在CRC 中表達上調，并且其表達上調與5-Fu化療耐藥有關。ZHAO 等［16］研究亦發現，CTCF 與腎細胞癌舒尼替尼化療耐藥有關，并且CTCF 有望成為預測腎細胞癌舒尼替尼化療耐藥的生物標志物。以上研究提示，CTCF可能參與多種惡性腫瘤的化療耐藥。

以往研究顯示，CTCF在多種惡性腫瘤中過表達并參與化療耐藥［11-12，16］，提示CTCF 過表達能夠降低CRC細胞對5-Fu或DDP的敏感性，這為探索CRC化療耐藥機制提供了新的研究方向。為了探索CTCF對HT29/5-Fu、HT29/DDP 細胞的影響，本研究采用瞬時轉染技術敲低HT29/5-Fu、HT29/DDP 細胞CTCF 蛋白表達，進一步觀察了敲低CTCF 對HT29/5-Fu 細胞和HT29/DDP 細胞存活率、侵襲能力和凋亡率的影響。結果發現，敲低CTCF后HT29/5-Fu細胞和HT29/DDP細胞存活率降低、侵襲能力減弱、凋亡率增加，說明了CTCF 表達降低可增加HT29/5-Fu、HT29/DDP 細胞對5-Fu 或DDP 的敏感性。進一步證實，CTCF與CRC 5-Fu或DDP化療耐藥有關，降低CTCF 表達可顯著增加HT29/5-Fu、HT29/DDP細胞對5-Fu或DDP的敏感性。

Hedgehog 信號通路與腫瘤發生及其惡性生物學行為密切相關，如腫瘤血管生成和腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲以及化療耐藥等［17-18］。LAI 等［15］研究證實，Hedgehog 信號通路相關基因富集與CTCF 表達顯著相關，CTCF 可通過激活Hedgehog 信號通路維持CRC 細胞增殖和化療耐藥。本研究結果發現，敲低CTCF 可顯著抑制HT29/5-Fu 細胞和HT29/DDP細胞Hedgehog 信號通路PTCH1、PTCH2、GLI1、SHH等關鍵蛋白表達，抑制Hedgehog 信號通路傳導。結果提示，敲低CTCF 可能通過抑制Hedgehog 信號通路傳導提高HT29/5-Fu 細胞和HT29/DDP 細胞對5-Fu或DDP的敏感性。

綜上所述，敲低CTCF 可抑制5-Fu、DDP 耐藥CRC 細胞增殖、侵襲并誘導其凋亡，其機制可能與抑制Hedgehog信號通路有關。