下調S100A8表達對卵巢癌細胞惡性生物學行為的影響及其機制

趙瑋瑋，王華，鄭艷莉

1 復旦大學附屬婦產科醫院病理科，上海 200090；2 南通市第一人民醫院婦產科

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，由于其發病隱匿，早期癥狀不典型，多數患者就診時已進展至中晚期，預后較差，5年生存率不足30%［1-2］。即使經手術和化療病情得到完全緩解，80%患者在治療后兩年內仍有復發可能［3］。近年來，隨著生物技術和分子生物學不斷發展，分子靶向治療成為繼手術、放療、化療之后的又一腫瘤治療手段。S100鈣結合蛋白A8（S100A8）屬于S100蛋白家族成員之一，最初發現其與許多炎癥性疾病有關［4］，近年發現S100A8在腫瘤發生、發展中亦發揮重要作用［5］。有研究報道，卵巢癌患者血清S100A8蛋白表達顯著升高，并且其表達升高與病情進展密切相關［6］。MIRICESCU等［7］研究表明，卵巢癌的發生、發展與信號通路異常息息相關，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路激活能夠促進卵巢癌細胞增殖、侵襲并抑制其凋亡。2020年5月—2021年5月，本研究探討了下調S100A8表達對卵巢癌細胞惡性生物學行為的影響及其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞株SKOV3，購自中國科學院上海細胞庫。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。S100A8-siRNA、NC-siRNA由美國芝加哥大學醫學中心分子腫瘤實驗室惠贈。SLAN-96P實時熒光定量PCR儀，購自上海宏石醫療科技有限公司；Varioskan LUX多功能酶標儀、熒光倒置顯微鏡，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；紫外可見分光光度計，購自南京菲勒儀器有限公司；DYCP-31DN型蛋白電泳儀，購自北京六一生物科技有限公司。Lipofectamine2000，購自美國Invitrogen 公司；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒，購自上海兢準基因醫學科技有限公司；MTT試劑盒，購自北京華美生科生物技術有限公司；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；細胞劃痕檢測試劑盒，購自廣州億寧生物技術有限公司。兔抗人PI3K、Akt單克隆抗體，購自美國Cell Signaling Technology 公司；GAPDH單克隆抗體，購自上海群己生物科技有限公司。

1.2 細胞傳代培養 將低溫冷藏的SKOV3 細胞置于37 ℃水浴快速解凍，3 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，棄上清液。然后加入含10% FBS 的RPMI 1640 培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。待貼壁細胞90%以上融合時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3 傳代。取傳3 代、對數生長期、生長狀態良好的SKOV3細胞進行后續實驗。

1.3 細胞轉染 取傳3 代、對數生長期、生長狀態良好的SKOV3 細胞，以2.5 × 103個/孔接種于96 孔板，隨機分為對照組、空轉組、S100A8 組，每組設3個復孔，然后將96 孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。常規培養24 h，按Lipo?fectamine2000 說明，S100A8 組轉染S100A8-siRNA，空轉組轉染NC-siRNA，對照組僅加入轉染試劑。轉染36 h，收集細胞。采用TRIzol法提取細胞總RNA，經紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格。然后將總RNA 逆轉錄為cDNA，逆轉錄條件：42 ℃ 60 min、72 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按實時熒光定量PCR 試劑盒說明進行PCR 擴增。引物序列：S100A8 上游引物5′-GCAACGUCAUUGAA?GUCUATT-3′、下游引物5′-UAGACUUCAAUGAC?GUUGCTT-3′，β-actin 上游引物5′-UUCUCCGAAC?GUGUCACGUTT-3′、下游引物5′-ACGUGACAC?GUUCGGAGAATT-3′。按實時熒光定量PCR試劑盒說明配制反應體系。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s、58 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s共40個循環。PCR 擴增反應結束，繪制熔解曲線，收集循環閾值（CT）數。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCT法計算S100A8 mRNA相對表達量。

1.4 細胞增殖活性檢測 收集各組轉染后細胞，調整細胞密度為5 × 103個/mL，接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。分別于繼續培養24、48、72 h，每孔加入5 g/L MTT試劑20 μL，避光孵育4 h；終止培養，吸棄孔內培養上清液，每孔加入DMSO 溶液200 μL，振蕩混勻，使結晶物充分溶解。酶標儀于490 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值。以OD490值作為細胞增殖活性。

1.5 細胞凋亡檢測 收集各組轉染后細胞，以1 ×105個/孔接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。繼續培養24 h，胰蛋白酶消化，離心棄上清，收集細胞沉淀。然后用Binding Buffer 200 μL重懸，依次加入Annexin V-FITC 10 μL、PI 10 μL，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，再加入Binding Buffer 300 μL，1 h 內上流式細胞儀檢測。

1.6 細胞遷移能力檢測 收集各組轉染后細胞，以1 × 104個/孔接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。待細胞鋪滿孔底后，用1 mL無菌加樣槍頭垂直劃一條直線，PBS沖洗，加入無血清的細胞培養基繼續培養24 h。分別于劃痕后0、24 h 倒置顯微鏡下拍照并測量劃痕距離，計算遷移距離。遷移距離=0 h 劃痕距離-24 h 劃痕距離。以遷移距離代表細胞遷移能力。

1.7 PI3K、Akt 表達檢測 ①PI3K、Akt mRNA 表達檢測。收集各組轉染后細胞，采用TRIzol 法提取細胞總RNA，經紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格。然后將總RNA 逆轉錄為cDNA，逆轉錄條件：42 ℃ 60 min、72 ℃ 5 min。以cDNA 為模板，按實時熒光定量PCR 試劑盒說明進行PCR 擴增。引物序列：PI3K 上游引物5′-GACTC?CAAGATGAAGAAGATGTG-3′、下游引物5′-GAG?CATTCGCAGGTVCAAGCC-3′，Akt 上游引物5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′、下游引物5′-CC?GGAAGTCCATCGTCTCCT-3′，β-actin 上游引物5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′、下游引物5′-GT?CACGCACGATTTCCGCT-3′。按實時熒光定量PCR試劑盒說明配制反應體系。反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s、58 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s共40個循環。PCR 擴增反應結束，繪制熔解曲線，收集CT 數。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCT法計算PI3K、Akt mRNA 相對表達量。②PI3K、Akt 蛋白表達檢測。收集各組轉染后細胞，加入含PMSF 的RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，經BCA 法蛋白定量合格。然后加入等體積的上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白20 μg，SDS-PAGE分離。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，分別加入兔抗人PI3K、Akt、GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜。次日洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG二抗，室溫孵育60 min，ECL發光，暗室內曝光、顯影。全自動凝膠成像儀拍照，Alpha View 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析或重復測量數據方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組S100A8 mRNA 表達比較 對照組、空轉組、S100A8 組S100A8 mRNA 相對表達量分別為1.00 ± 0.00、0.96 ± 0.03、0.54 ± 0.08。S100A8 組S100A8 mRNA 相對表達量顯著低于對照組和空轉組（P均＜0.05），而對照組與空轉組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 三組培養不同時間細胞增殖活性比較 見表1。

表1 三組培養不同時間細胞增殖活性比較（±s）

表1 三組培養不同時間細胞增殖活性比較（±s）

注：與對照組同時間比較，*P＜0.05；與空轉組同時間比較，#P＜0.05；與同組培養24 h 比較，△P＜0.05；與同組培養48 h 比較，▲P＜0.05。

組別細胞增殖活性培養72 h 0.90 ± 0.07 0.80 ± 0.06 0.40 ± 0.05*#△▲對照組空轉組S100A8組培養24 h 0.95 ± 0.04 0.87 ± 0.05 0.69 ± 0.05*#培養48 h 0.92 ± 0.06 0.83 ± 0.03 0.53 ± 0.07*#

2.3 三組細胞凋亡率比較 對照組、空轉組、S100A8 組細胞凋亡率分別為（4.35 ± 1.33）%、（5.70 ± 1.58）%、（21.35 ± 2.56）%。S100A8 組細胞凋亡率顯著高于對照組和空轉組（P均＜0.05），而對照組與空轉組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 三組細胞遷移能力比較 對照組、空轉組、S100A8 組細胞劃痕距離分別為（155.40 ± 8.60）、（153.90 ± 9.14）、（82.05 ± 3.68）μm。S100A8 組劃痕距離顯著低于對照組和空轉組（P均＜0.05），而對照組與空轉組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 三組PI3K、Akt表達比較 見表2。

表2 三組PI3K、Akt蛋白和mRNA相對表達量比較（±s）

表2 三組PI3K、Akt蛋白和mRNA相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與空轉組比較，#P＜0.01。

組別對照組空轉組S100A8組PI3K蛋白1.00 ± 0.00 0.96 ± 0.02 0.54 ± 0.05*#mRNA 1.50 ± 0.08 1.44 ± 0.09 0.84 ± 0.05*#mRNA 2.09 ± 0.03 2.00 ± 0.10 0.98 ± 0.08*#Akt蛋白1.00 ± 0.00 0.96 ± 0.04 0.42 ± 0.05*#

3 討論

卵巢癌是女性惡性腫瘤相關死亡的第五大原因，其死亡率居婦科惡性腫瘤首位。卵巢癌發病隱匿，早期癥狀不典型，多數患者就診時已進展至中晚期，預后較差，5年生存率不足30%［1-2］。即使經手術和化療病情得到完全緩解，80%患者在治療后兩年內仍有復發可能［3］。近年來，隨著生物技術和分子生物學不斷發展，分子靶向治療成為繼手術、放療、化療之后的又一腫瘤治療手段。因此，探索卵巢癌發生、發展的分子機制，尋找其分子靶標，從而篩選合適的靶向治療藥物，對提高中晚期卵巢癌預后具有重要意義。

S100蛋白家族是一個鈣結合蛋白家族，在體內能夠與鈣離子相互作用而發揮多種生物學作用［8］。S100A8是S100蛋白家族成員之一，具有組織特異性和細胞特異性，通常在中性粒細胞和單核細胞內表達。最初發現S100A8與許多炎癥性疾病有關［4］，近年發現其在腫瘤發生、發展中亦發揮重要作用［5］。有研究報道，胰腺癌組織S100A8表達顯著高于其癌旁正常組織［9］；在宮頸癌細胞中下調S100A8表達能夠抑制腫瘤細胞惡性生物學行為［10］。ICHIKAWA 等［11］將MC38細胞注射入小鼠體內發現，S100A8敲除小鼠較野生型小鼠移植瘤的發生率明顯降低，轉移灶亦明顯減少。以上研究為S100A8在腫瘤發生、發展中的作用提供了實驗證據。有研究發現，S100A8能夠促進鼻咽癌CNE2細胞增殖、遷移和基質黏附等生物學行為，其機制可能與激活Wnt/β-catenin 信號通路有關［12］。CORTESI等［13］研究表明，卵巢癌組織S100A8表達顯著高于正常卵巢組織。本研究采用瞬時轉染技術下調S100A8 表達，結果發現S100A8 組S100A8 mRNA相對表達量顯著低于對照組和空轉組，而對照組與空轉組比較差異無統計學意義。結果證實，該技術能夠使SKOV3細胞S100A8表達下調。進一步研究發現，S100A8組細胞增殖活性和遷移能力均顯著低于對照組和空轉組，細胞凋亡率顯著高于對照組和空轉組，而對照組與空轉組細胞增殖活性、凋亡率和遷移能力比較差異均無統計學意義。結果表明，下調S100A8表達能夠抑制卵巢癌細胞惡性生物學行為。

PI3K/Akt信號通路在真核生物的調控網絡中普遍存在，具有調控細胞周期、參與血管生成及促進上皮間質轉化等作用［14］，是目前研究較多的信號通路之一。目前認為，PI3K/Akt信號通路異常激活與惡性腫瘤的發生、發展有關。有研究在乳腺癌患者中發現PI3K/Akt信號通路異常激活，并且其異常激活能夠促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移［15］。在宮頸癌中PI3K/Akt信號通路處于活躍狀態，并通過誘導上皮間質轉化促進腫瘤細胞侵襲和遷移。當卵巢癌細胞大量增殖時，PI3K/Akt信號被磷酸化，通過介導下游信號通路mTOR活性，促進卵巢癌細胞向遠處遷移［16］。因此，卵巢癌細胞PI3K/Akt信號通路激活能夠促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移。本研究結果發現，S100A8組PI3K、Akt蛋白與mRNA相對表達量均顯著低于對照組和空轉組，而對照組與空轉組比較差異均無統計學意義。提示下調S100A8表達能夠抑制PI3K/Akt信號通路激活。

綜上所述，下調S100A8表達能夠抑制卵巢癌細胞增殖和遷移并促進其凋亡，其機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路激活有關。