宮頸脫落細(xì)胞CircRNA 000284檢測在宮頸癌篩查中的作用

巢 薇,覃鳳嫻,鄒 燕,岑福柱,劉小勇

(1.柳州市工人醫(yī)院,廣西 柳州 545000;2.柳州市柳鐵中心醫(yī)院,廣西 柳州 545000)

宮頸癌是最常見的一種婦科惡性腫瘤之一，每年宮頸癌在全球女性惡性腫瘤中發(fā)病率及致死率均高居第四位。盡管發(fā)達(dá)國家的子宮頸癌病例發(fā)病率在過去十年中有所下降，但發(fā)展中國家的發(fā)病率繼續(xù)迅速上升。每年具有大約52.9萬新病例和27.5萬人死亡，且發(fā)病率趨于年輕化[1-2]。目前臨床宮頸癌篩查最常用的方法是高危型人乳頭瘤病毒(HPV)檢測及宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，但高危型HPV檢測存在靈敏度高但特異性較差的缺陷，而宮頸細(xì)胞學(xué)檢查則存在特異性高但靈敏度差的缺陷[3-4]。尋求一種靈敏度、特異性均理想的新型宮頸癌臨床診斷標(biāo)志物勢在必行。CircRNA是近年來研究較熱的一類新型非編碼RNA[5]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。目前文獻(xiàn)報(bào)道較多的是一些CircRNA在宮頸癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，而現(xiàn)階段有關(guān)CircRNA在宮頸脫落細(xì)胞中表達(dá)情況尚未見報(bào)道。本文探討CircRNA000284在宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1一般資料：選取2019年1月～2021年12月柳州市工人醫(yī)院收治的宮頸癌患者92例(宮頸癌組)，均經(jīng)臨床病理檢查確診，年齡33～75歲，平均(53.9±10.1)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)分類標(biāo)準(zhǔn)[6]，且經(jīng)病理確診為宮頸癌者；②術(shù)前均未接受放射治療、化療或生物免疫治療者；③能配合本次研究及病歷資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②術(shù)前已行放療、化療或生物免疫治療者；另取同期50例健康體檢女性作為對照組。獲取醫(yī)療記錄以審查患者數(shù)據(jù)，包括年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級、國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮頸浸潤深度。所有研究對象簽署知情同意書，本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。宮頸癌患者與對照組年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2CircRNA 000284檢測：采用Trizol試劑從宮頸脫落細(xì)胞中提取總RNA,用分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度，并將1 μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real-time PCR反應(yīng)：按照試劑盒說明書操作，CDNA 2 μl，GeenRemix TaqⅡ(2×)10 μl,上、下游引物各0.8 μl，ROX 0.4 μl無酶水6 μl，總反應(yīng)體系共20 μl。反應(yīng)條件：95℃ 15 s，60 ℃ 1 min共40個(gè)循環(huán)，95℃ 30 s，60℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。Real-time PCR 使用 ABI 7500 擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、熒光擴(kuò)增試劑及引物均購買于日本Takara公司。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別計(jì)算各標(biāo)本平均循環(huán)閾值(CT值)，根據(jù)公式2-ΔΔCt，計(jì)算CircRNA 000284的相對表達(dá)量。2-ΔΔCt數(shù)值越大表示對應(yīng)的CircRNA相對表達(dá)水平越高，2-ΔΔCt數(shù)值越小表示相對應(yīng)的CircRNA相對表達(dá)水平越低。引物序列CircRNA 000284正義鏈：5′-TATGTTGGTGGATCCTGTTCGGCA-3′，反義鏈：5′-TGGTGGGTAGACCAAGACTTGTGA-3′；GAPDH正義鏈：5′-GAAGGTGAAGG TCGGAGTC-3′,反義鏈：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.3高危型HPV分型：采用ROCHE Cobas4800全自動核酸提純及熒光PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行HPV分型核酸檢測，可檢出HPV-16、HPV-18以及其他12種高危型 HPV(31/33/51/52/53/58/66/35/39/45/56/59)感染。判斷標(biāo)準(zhǔn):CT<41.0判讀為HPV陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1宮頸脫落細(xì)胞中CircRNA 000284的相對表達(dá)量分析:宮頸癌組的CircRNA 000284的相對表達(dá)量(2.05)，明顯高于對照組的相對表達(dá)量(1.0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.8，P<0.01)。

2.2不同臨床病理特征宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞CircRNA 000284相對表達(dá)量比較：宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞中CircRNA 000284相對表達(dá)量與FIGO分期、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、間質(zhì)浸潤深度、脈管間隙浸潤有關(guān)(P<0.05)，而與腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 宮頸癌患者宮頸脫落細(xì)胞CircRNA 000284水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.3CircRNA 000284與高危型HPV分型檢測對宮頸癌患者診斷結(jié)果比較：CircRNA 000284單一檢測敏感性、特異性、診斷符合率均高于高危型HPV分型檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 CircRNA 000284與高危HPV分型檢測檢測對宮頸癌患者診斷結(jié)果比較[n(%)]

3 討論

CircRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，參與了許多重要的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞凋亡、增殖、分化、代謝等過程。大量研究發(fā)現(xiàn)CircRNA與多種惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展相關(guān)，目前在宮頸癌中已發(fā)現(xiàn)一些異常表達(dá)的CircRNA[7-9]。

目前臨床研究已表明，高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的最關(guān)鍵致病因素[10]，歐洲生殖道感染和腫瘤研究組織已經(jīng)推薦其作為宮頸癌篩查的初篩手段。但由于其存在靈敏度高但特異性較差的缺陷，初篩結(jié)果的高陽性率往往會給一些患者帶來不必要的心理焦慮。本研究將CircRNA000284與高危型人乳頭瘤病毒分型結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明CircRNA000284敏感性、特異性、診斷符合率均優(yōu)于高危型HPV分型檢測，說明CircRNA000284對于宮頸癌中診斷應(yīng)用價(jià)值更高。此外，本研究檢測所用的宮頸脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本比傳統(tǒng)的有創(chuàng)性活組織檢查方法更為簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)、安全，可全面了解腫瘤的異質(zhì)性，更切合精準(zhǔn)醫(yī)療的理念[11]。

綜上所述，檢測宮頸脫落細(xì)胞中的CircRNA000284，可以用于宮頸癌患者的診斷及病情評估，具有較高的敏感性、特異性及診斷符合率，其有望成為宮頸癌診斷和監(jiān)測的新型生物標(biāo)志物。