脈沖標記下甘蔗13C富集及氮磷鉀含量變化

桂意云 李海碧， 韋金菊 周 會 祝 開 趙培方 劉昔輝， 區惠平，

（1中國農業科學院甘蔗研究中心∕廣西農業科學院甘蔗研究所∕農業農村部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室∕廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007；2廣西南亞熱帶農業科學研究所，廣西 崇左 532400；3云南省農業科學院甘蔗研究所，云南 開遠 661699）

穩定性同位素13C脈沖標記技術是研究植物光合作用及其光合碳在植物-土壤-大氣系統中周轉規律的科學高效方法之一［1-3］。借助穩定性同位素13C脈沖標記技術，可了解植物各生育時期光合碳的分配信息［4］，也可科學區分不同碳源，從而更好地揭示土壤有機碳及其組分的分解程度和周轉速率，以及示蹤碳的遷移轉化過程［5-6］。目前，科研用13C標記材料主要通過脈沖標記獲取。國內外許多學者標記的材料主要涉及小麥［1-3］、水稻［7-8］、玉米［9-11］、大豆和濕地植物［12］等。霍莉莉等［12］研究表明，每次標記通入豐度99%、純度99.999%的13CO2氣體10 L 4 h，共標記4次，所獲得的濕地植物根、莖和葉的Atom%13C是未標記植物的1.03、1.78和0.91倍，大豆根、莖和葉的Atom%13C是未標記的1.20、2.19和2.99倍，大豆標記效果優于濕地植物。由此可知，不同作物的標記效果存在差異。

甘蔗（Saccharumspp.）是全球重要的能源作物和糖料作物。甘蔗光合CO2補償點低（1～10 mg·m-3），光合作用最適溫度高（30～45 ℃），CO2固定效率和同化率高，因此，甘蔗被認為是碳中和背景下優選的C4作物［13］。利用穩定性同位素13C脈沖標記技術研究甘蔗光合作用、光合碳去向以及碳周轉是當前應對全球氣候變化影響的研究熱點之一。然而，利用穩定性同位素13C脈沖標記技術探討甘蔗13C富集的研究較少，亟需開發一種簡單易行、低量高效、經濟實用的標記方法。因此，本研究以甘蔗品種桂糖58號為試驗材料，探索苗期甘蔗13C脈沖標記方法及標記效率，同時分析脈沖標記期間甘蔗營養元素的變化，旨在為甘蔗同位素的高效標記以及標記期間甘蔗的養分管理提供參考依據，并為進一步研究甘蔗秸稈碳在大氣-植物-土壤中的周轉提供科學材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤采自廣西農業科學院院本部甘蔗試驗地，采樣深度0～15 cm。土壤取回后自然風干，去除植物殘體，粉碎、研磨過2 mm篩備用。土壤理化性質為：pH（H2O，土∶水=1∶2.5）值6.18，有機質含量17.1 g·kg-1，堿解氮含量48.3 mg·kg-1，速效磷含量0.3 mg·kg-1，速效鉀含量75.6 mg·kg-1。供試甘蔗品種為桂糖58號（GT58），由廣西農業科學院甘蔗研究所提供。

1.2 桶栽試驗

試驗在廣西農業科學院甘蔗研究所智能溫室大棚采用桶栽進行。試驗用桶直徑25 cm，高35 cm，每桶裝過2 mm篩的風干土15 kg。每桶施用尿素30 g，鈣鎂磷肥37 g，硫酸鉀20 g。2020年3月18日進行甘蔗催芽，3月25日選取長勢一致的蔗苗移栽至試驗桶內，每桶4株，共種植42桶。

1.3 13C脈沖標記試驗

試驗于2020年5月11日開始，設置0、0.32、0.64和1.28 g·m-3Na213CO34個用量水平，分別記為CK、T1、T2和T3。CK擺放在單獨的溫室大棚內，避免污染。標記在自制全密閉標記室進行。標記室由聚乙烯膜和直徑20 mm的聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）塑管支架制成，其長×寬×高分別為1.25 m×1 m×1.25 m。內置1臺外控小風扇、溫度計、2個裝13C豐度為99%的Na213CO3的燒杯（對角放），外置2個裝鹽酸的輸液瓶。標記每隔7 d進行1次，共標記6次。標記時間為10：00—16：00。標記步驟如下：標記前，將栽植甘蔗的試驗桶放進標記室，每處理放置9桶；用透明膠帶粘貼密封出入口；開啟標記室內頂端中間的風扇；5 min后，迅速通過外置輸液瓶向標記室內裝有Na213CO3的燒杯中一次性注入100 mL 2 mol·L-1的HCl（確保室內的Na213CO3完全反應，釋放13CO2）；標記結束后，關閉風扇，將甘蔗移出標記室，放置于溫室大棚，常規管理。

1.4 樣品采集與制備

分別在第2、第4和第6次標記結束后的第7天隨機選擇標記和未標記的甘蔗各3桶進行破壞性采樣。從基部剪斷蔗葉（標記時甘蔗處于苗期，以蔗葉為主），同時將全部土壤倒出平鋪于干凈的農膜上，挑出根系，先用自來水沖洗根系上黏附的土壤，再用蒸餾水洗凈、瀝干后，將蔗葉與根系分別置于105 ℃烘箱中殺青15 min，65 ℃恒溫烘干至恒重，粉碎過100目篩待測。同時，在第6次標記開始時（注酸后2 min）及結束后均用注射器采集標記室內的氣體用于CO2濃度和δ13C-CO2分析。

1.5 分析方法

蔗葉及根系的N含量采用凱氏定氮法測定，P含量采用鉬藍比色法測定，K含量采用火焰光度法測定［14］。蔗葉全碳含量以及δ13C值采用元素分析儀-同位素質譜儀（德國Elementar公司）測定，CO2濃度和δ13C-CO2采用高精度碳同位素分析儀（美國Picarro公司）測定。

1.6 數據處理[12, 15]

未標記作物的自然豐度用δ13C值表示，其計算公式如下：

式中，RS為樣品的13C∕12C值；PDB為標準物質，RPDB為標準物質的13C∕12C值，為0.011 237 2。

標記作物的同位素豐度用F（%）來表示，F（%）與δ13C（‰）的轉化公式如下：

蔗葉、根系固定的13C量計算公式如下：

式中，13C為蔗葉的13C量（mg）；C為蔗葉全C含量（g）；F為標記組13C豐度；Fck為未標記組13C豐度。蔗葉、根系標記效率Em計算公式如下：

式中，Cat為添加到標記室的13C總量，其中1 g純度為99%的Na2

13CO3中含13C量為0.12 g。采用Excel 2007和Origin 8.0軟件作圖，DPS統計軟件進行數據統計，最小顯著差異法（least significant difference， LSD）進行多重比較。

“動物行為的生理基礎”是蘇教版初中《生物學》教材八年級上冊第18章“動物的行為”第2節內容，包含“動物行為的獲得途徑”和“動物行為的生理基礎”兩部分。

2 結果與分析

2.1 標記室CO2和δ13C-CO2濃度變化

由表1可知，標記開始時各處理的標記室內CO2濃度約為960.0 mg·m-3，各處理間差異不顯著；標記6 h后，CO2濃度降至551.7～750.5 mg·m-3之間，各處理間差異顯著，同時該濃度較標記開始時下降21.7%～42.3%，以T2處理降幅最大，高達42.3%，T3處理次之（40.1%），T1和CK處理較低，約為22%，與T2和T3差異顯著。

表1 標記室內CO2濃度變化Table 1 The change of CO2 concentration in close chamber

由表2和圖1可知，標記開始時，每增加1個Na2

圖1 標記開始時標記室內δ13C-CO2特征Fig.1 The dynamic change of δ13C-CO2

表2 標記室內δ13C-CO2變化Table 2 The change of δ13C-CO2 in close chamber

13CO3標記濃度梯度，標記室內的δ13C-CO2以5 886.5‰的速率線性增加，標記結束后，δ13C-CO2整體呈下降趨勢，降幅為2 108.2～7 550.9個千分點，并隨Na213CO3標記濃度的增加而增加。

2.2 蔗葉和根系δ13C和F值動態特征

由圖2可知，蔗葉中的δ13C值高于根系。未標記的蔗葉和根系的δ13C值無明顯變化，分別為-0.80‰和-13.04‰。而標記的蔗葉和根系δ13C值隨著標記次數的增加而明顯富集，且蔗葉δ13C值增加速率隨著Na213CO3標記濃度的增加而增加，以T3處理的增加速率最高，每標記1次，蔗葉δ13C值增加85.841‰。根系δ13C值在T1處理下隨著標記次數的增加呈線性增加，每標記1次，根系δ13C值增加4.094‰。在T2和T3處理下，根系δ13C值與標記次數呈一元二次關系。

圖2 不同處理下蔗葉與根系的δ13C動態變化Fig.2 The dynamic change of δ13C in sugarcane leaves and roots among different treatments

由圖3可知，蔗葉和根系F值表現出與δ13C值同樣的變化趨勢。未標記的甘蔗蔗葉和根系的F值隨著標記次數的增加無明顯變化，其他Na213CO3標記濃度的甘蔗蔗葉F值隨著標記次數的增加呈線性增加，且蔗葉F值增加速率隨著Na213CO3標記濃度的增加而成倍增加，以T3處理增加速率最高，每標記1次，蔗葉F值平均約增加0.094%。根系F值在T1處理下隨著標記次數的增加呈線性增加，每標記1次，根系F值平均約增加0.004%。在T2和T3處理下，根系F值與標記次數呈一元二次關系。標記6次后，蔗葉F值較CK增加了0.08～0.40個百分點，根系F值較CK增加了0.03～0.29個百分點。

圖3 不同處理下蔗葉與根系的F值動態變化Fig.3 The dynamic change of F in sugarcane leaves and roots among different treatments

2.3 不同13CO2濃度脈沖標記次數下的標記效率

表3 不同13CO2脈沖標記次數下的標記效率Table 3 Labeling efficiency at different 13CO2 pulse labeling numbers /%

2.4 不同13CO2脈沖標記下蔗葉、根系中N、P、K含量變化

對蔗葉、根系中的N、P、K含量進行分析，有助于提升對13CO2脈沖標記下養分管理的認識。圖4表明，13C標記蔗葉的N含量整體顯著高于或相當于未標記蔗葉。P含量在標記4次后表現為T1和T2處理顯著高于CK處理，而T3處理顯著低于CK處理。13C標記蔗葉的K含量均顯著高于未標記蔗葉，增幅為6.0%～31.8%。標記6次后，T1和T2處理蔗葉N、P、K含量無顯著差異，但均顯著高于T3處理。

圖4還表明，標記4次后，除了T1處理的根系P含量顯著高于CK處理外，標記根系的N、P、K含量均整體顯著低于CK處理，其中N含量降幅為7.9%～32.9%，P含量降幅為0.9%～20.7%，K含量降幅為21.9%～47.9%。

圖4 不同處理下蔗葉與根系N、P、K含量變化Fig.4 The dynamic change of N， P and K in sugarcane leaves and roots among different treatments

將蔗葉N、P、K含量與根系N、P、K含量進行線性擬合（表4），結果表明，除了第4次標記的N含量外，蔗葉N、K含量與根系N、K含量均呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）負相關，蔗葉P含量與根系P含量均呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）正相關。

表4 蔗葉N、P、K含量與根系N、P、K含量的關系Table 4 Relationship between N， P and K content in sugarcane leaves and roots

3 討論

3.1 甘蔗不同器官13C富集情況

前人研究發現，不同13CO2標記植物的13C富集存在較大差異，有的δ13C值處于較高水平，如安婷婷等［10］研 究 發 現13CO2標 記 后 玉 米 莖 和 葉δ13C值 達1 500‰，尹云鋒等［8］研究發現13CO2標記后水稻葉片δ13C值達1 400‰，但杉木［15］、小麥與豌豆［16］、互花米草［17］等植物根、莖、葉的δ13C值在13CO2標記后仍較低，變化幅度在100.00‰～721.77‰之間，這可能是不同植物之間的差異造成的。前人研究還發現，葉部δ13C值大于根部［17-19］，這可能與葉片作為光合器官，更易富集13C有關。本研究中，甘蔗經過6次13CO2脈沖標記后，蔗葉和根系δ13C值分別達到74.5‰～366.2‰和10.6‰～253.6‰，且蔗葉δ13C值大于根部δ13C值，這與前人研究結果一致［17-19］。

3.2 Na213CO3標記濃度、次數與甘蔗13C富集的關系

前人研究表明，CO2是作物光合作用的原料，作物13C富集量在很大程度上依賴于該作物生長期間的大氣13C-CO2［20］，Na213CO3標記濃度顯著影響標記室內12CO2和13CO2的比例，進而影響作物13C的富集。本研究發現，隨著Na213CO3標記濃度的增加，標記室內Na213CO3與HCl反應生產的δ13C-CO2呈線性增加，標記結束后，標記室內δ13C-CO2下降（表2），同時蔗葉和根系δ13C值均較未標記蔗葉和根系明顯提高，且隨Na213CO3標記濃度的增加而增加（圖2），這表明，隨著Na213CO3用量的逐漸增加，13C-CO2濃度的升高促進了甘蔗光合同化大氣13CO2的比例，這與前人研究結果［20］一致。

本研究還發現，脈沖標記結束后的室內CO2濃度雖然下降至551.7～750.5 mg·m-3（表1），但甘蔗光合作用仍正常進行，隨著標記次數的增加，T1、T2和T3處理蔗葉δ13C值分別以17.82‰∕次，37.81‰∕次和85.84‰∕次 的 速 率 增 加，F值 分 別 以0.02%∕次、0.041%∕次和0.094%∕次的速率增加。造成該結果的原因可能是甘蔗屬于C4作物，具有較低的CO2補償點（10 mg·m-3）［21］，因此甘蔗在標記結束后仍具有較強的光合能力，且隨著標記次數和Na213CO3標記濃度的增加，蔗葉δ13C值和F值的增加速率均相應增加。

3.3 Na213CO3標記濃度、次數與甘蔗標記效率的關系

前人對不同作物在不同13CO2脈沖標記時間下的標記效率已有較多研究，結果均表明隨著標記時間的不斷增加，作物13C標記效率呈先上升后下降的變化規律。如孫海巖等［22］在玉米苗期利用13C標記1 h后，玉米-土壤系統13C同化率達到76.8%，標記結束30 d后降至34.2%；Bai等［23］利用13CO2脈沖標記楊樹的結果也表明，標記6 h后13C回收率為90%，21 d后降低至40%。本研究發現，每隔7 d進行1次標記，蔗葉和根系13C的標記效率均隨Na213CO3標記次數的增加而增加（表3），其中蔗葉在標記14 d（2次）、28 d（4次）和42 d（6次）下的13C標記效率分別為1.51%～3.45%、20.19%～32.15%和32.62%～40.74%，這與上述研究結果相近。但甘蔗標記效率在多長標記時間后開始下降還需進一步研究。此外，楊樹標記21 d［23］、園林植物標記21 d［24］和牧地植物標記30 d［25］后，13C標記效率處于下降水平，而本研究中甘蔗標記效率在42 d（6次）仍處于上升趨勢，這可能是由于甘蔗是C4作物，具有較高的光合作用水平。

出于成本和標記效率考慮，Na213CO3的標記濃度和標記次數均應在滿足作物13C豐度需求的前提下減少。沈其榮等［26］指出植物δ13C值相差一倍左右即可作為天然材料示蹤天然碳周轉動態。Weng等［5］利用δ13C值為16.6‰以上的蔗葉和蔗葉生物炭闡明了蔗葉和蔗葉生物炭還田下植物N吸收的來源，說明δ13C值為16‰以上的蔗葉材料即可滿足研究的需求。本研究中，對比T1、T2和T3處理下蔗葉δ13C值的增加速率，在T1處理標記4次、Na213CO3總用量最少時即可滿足蔗葉δ13C需求，但該處理下的蔗葉13C標記效率（20.19%）較低，因此，如何保證甘蔗低成本投入和13C標記高效率產出還需繼續深入研究和探索。

3.4 13C標記與作物N、P、K含量變化的關系

N、P、K通過參與碳水化合物的代謝，直接或間接影響光合作用［20］。而大氣CO2濃度升高帶來的光合作用增強，或植物光合同化CO2過程中發生的同位素分餾也可能改變植物的生理代謝過程，進而影響植物體內的養分吸收與分配模式［27-28］。前人關于13C標記與作物N、P、K含量變化的關系還存在一定的爭議。有研究表明植株δ13C值隨葉片N、P、K含量的增加而升高［29］。但也有研究表明，13C標記前后植物N含量無明顯變化［16］。本研究結果表明，13C標記蔗葉的N、K含量顯著高于或相當于未標記蔗葉，標記4次后，P含量在T1和T2處理顯著高于CK處理，這與洪凱等［30］在杉木上的研究結果一致。原因主要是標記引發的CO2短期加富提高了作物葉片凈光合速率和光能利用效率，從而增強了植物對養分的吸收能力［30］。標記前后CO2以及13C-CO2的變化也進一步印證了13C標記增強了甘蔗的光合作用這一結果。標記4次后，除T1處理根系的P含量外，標記根系的N、P、K含量均整體顯著低于未標記根系，N、P、K含量降幅分別為7.9%～32.9%、0.9%～20.7%、21.9%～47.9%。蔗葉與根系N、P、K含量關系進一步表明，除了第4次標記的N含量，蔗葉N、K含量與根系N、K含量均呈顯著或極顯著負相關，蔗葉P含量與根系P含量均呈顯著或極顯著正相關，說明13C標記促進了甘蔗根系N、K向蔗葉遷移。

4 結論

在密閉標記時間內，外源釋放的13CO295%以上被甘蔗光合作用所利用。蔗葉δ13C值和F值隨標記次數和Na213CO3標記濃度的增加而明顯增加。總體來說，在甘蔗苗期，每隔7 d標記一次，每次采用0.32 g·m-3Na213CO3與HCl反應生成13CO2標記6 h，共標記4次即可獲得經濟適用的13C富集蔗葉。13C脈沖標記影響了甘蔗體內N、P、K的吸收與分配，促進了根系N、K向蔗葉遷移。