基于IRAP標記的沙子空心李遺傳多樣性評價及指紋圖譜構建

王貴，李蕊蕊，吳茂宏，任菲宏，王麗麗，喬光

1.貴州大學生命科學學院/山地植物資源保護與種質創新教育部重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州省銅仁市林業科學院，銅仁 554300；3.貴州省銅仁市農業科學院，銅仁 554300； 4.貴州省農業科學院，貴陽 550006

沙子空心李（Prunus salicinaLindl. ‘Shazikongx?inli’），為薔薇科李屬植物、青皮黃肉李品種，是貴州省沿河土家族自治縣栽培的地方特色水果，于2006年被批準為國家地理標志保護產品［1］。據沿河縣縣志記載，沙子空心李系1858年由外地引進栽培，屬中國李的一類地方品種，由于沿河縣獨特的地理、氣候和富含硒等多種微量元素的土壤條件適宜其生長，逐漸育成了這一優異地方李品種。目前沙子空心李主栽于沿河縣南莊村沙子、中界等鄉鎮，投產種植面積已達30 km2，還未發現過野生資源。經過160多年的自然演變及人為選育栽培，沙子空心李逐漸形成品種群。近年來沿河縣大面積發展沙子空心李，種苗生產混亂、接穗來源異質化，進一步促成沙子空心李品種的多樣化［2］。通過筆者所在課題組走訪調查發現，目前生產的沙子空心李在成熟時間及果實品質上存在差異。差異株系的存在為優異種質的挖掘提供了種質資源基礎，但這些差異是僅由環境因素或栽培技術不同引起的，還是遺傳信息發生不同程度的變異尚未明確。只有了解種質資源的遺傳變異水平及親緣關系，才能高效地選配親本，培育出優異品系［3］。因此，有必要通過DNA分子標記技術從基因水平上對沿河縣沙子空心李種質資源進行遺傳多樣性評價。

DNA分子標記技術，如RAPD、SSR及ISSR，已經廣泛用于李研究的不同領域［4］，但IRAP（inter-ret?rotransposon amplified polymorphism，逆轉座子位點擴增多態性）標記的應用研究還鮮有報道。IRAP是 Kalendar等［5］于1999年基于植物反轉錄轉座子轉座特性而建立的一種分子標記技術，具有高通量、基因組覆蓋范圍廣、多態性豐富及異質性高等優點［6-7］。現已應用于櫻桃［8］、梨［9］、葡萄［10］、火龍果［11-12］、梅［13］等親緣關系鑒定及遺傳多樣性分析等研究。

本研究依據品種成熟期、果實品質、高產穩產這幾個育種目標選擇了92株具有優良性狀的沙子空心李作為試驗材料，采用IRAP標記技術，系統評價供試材料遺傳多樣性水平及親緣關系，同時構建沙子空心李指紋圖譜，旨在為沙子空心李優異種質的輔助育種、科學利用及保護等提供理論依據與應用參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2020年7月對貴州省沿河縣南莊村等地進行實地走訪調查，選取92株具有優良性狀（高品質、高產穩產等）、健康的沙子空心李作為試驗材料（表1）。于2022年4月取92份供試種質的幼嫩葉片，用于后續基因組DNA提取。

表1 92份沙子空心李種質材料Table 1 Ninety-two germplasm resources of Shazikongxinli for IRAP analysis

續表 1 Continued Table 1

續表 1 Continued Table 1

1.2 基因組DNA提取

通過植物基因組DNA提取試劑盒DP320（北京，天根）提取92份供試材料幼嫩葉片DNA后，經1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測質量及濃度后，將DNA稀釋至約30 ng/μL，置于-20 ℃保存。

1.3 IRAP引物開發

通過Clustal W對李反轉錄轉座子Ty1-copia和Ty3-gypsy的RT序 列（NCBI：K78998～K79023；K79024～K79041）進行多序列比對，獲得保守區域，采用Primer 5.0程序以保守區域上游序列設計單向引物［14］，共獲得65條IRAP引物，由上海生工合成。

1.4 IRAP-PCR體系優化

設計L16（ 43） 正交試驗（表2）優化10 μL沙子空心李IRAP-PCR反應體系的主要影響因素Mix（賽默飛；0.4 mmol/LTaqDNA聚 合酶、0.4 mmol/L dNTP、4 mmol/L MgCl2）、IRAP引物和模板DNA的用量；PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，51～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存；在此基礎上對PCR循環次數設置3個梯度：30、35及40次。

表2 L16（ 43 ） 正交試驗表Table 2 Table of L16（43） orthogonal experiments μL

1.5 IRAP引物篩選與PCR擴增

根據已優化的10 μL IRAP-PCR體系，隨機選取8個供試種質DNA作為模板，利用篩選出來的IRAP引物對92份沙子空心李種質進行PCR擴增，每個引物重復2～3次，PCR產物在1×TAE緩沖液中用1.5%瓊脂糖凝膠以6 V/cm電泳40 min后，于凝膠成像系統中觀察并保存圖像。

1.6 數據處理與分析

僅統計每個引物清晰明亮且可重復的條帶，有和無條帶分別以“1”和“0”記錄，獲得每個引物的數據矩陣，通過POPGEN 1.32［15］分析每個IRAP引物的等位基因數、有效等位基因數、Nei’s基因多樣性指數及Shannon指數；利用NTSYS 2.10e軟件［16］計算遺傳相似性系數后，通過MEGA11采用鄰接法（neighbor-joining）進行聚類，利用Evolview（http：//evolgenius.info）美化聚類圖。根據使用最少引物鑒定盡量多供試種質的原則，確定核心引物，直接以統計獲得的0/1數據作為指紋代碼，通過條形碼和二維碼生成器（http：//qr-batch.com/）構建供試種質分子身份證。

2 結果與分析

2.1 PCR反應體系優化

PCR體系優化試驗見圖1，泳道1～16分別對應正交試驗表（表2）中體系1～16，PCR循環次數依次為30、35、40。PCR結果顯示，循環40次為最優。根據40次循環中電泳條帶的數量、明暗及清晰度，16個PCR體系從優到差的排序為：7-12-11-16-3-4-8-2-6-14-15-10-5-9-1-13。通過對上述處理的各個因子比較可知，IRAP引物和Mix含量是影響條帶多少及明暗程度的主要因素。體系1、5、9、13中Mix含量（3.0 μL）最少，條帶均較少且不明亮；而體系2、6、10、14中Mix含量（4.0 μL）相同，體系10及14引物含量（0.7 μL及1.0 μL）相對較少，導致PCR結果相對較差；同理，體系8及15也是如此。綜上，考慮經濟成本等因素，確定PCR體系（10 μL）最優為體系7：10-5mol/L IRAP引 物1.3 μL，PCR Mix 5.0 μL、模板DNA（30 ng/μL）1.0 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，51～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40次循環；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。

圖1 10 μL IRAP-PCR體系優化結果Fig.1 Optimization results of 10 μL IRAP-PCR system

2.2 IRAP引物篩選

對設計的65條IRAP引物進行篩選，最終篩選出18條多態性良好、條帶清晰且可重復性強的IRAP引物，且確定最佳退火溫度為51～58 ℃（表3），部分引物篩選結果見圖2。

圖2 6條IRAP引物篩選結果Fig.2 Screening results of 6 IRAP primers

表3 18條IRAP引物信息Table 3 Information of 18 IRAP primers

2.3 IRAP引物多態性分析

通過篩選出的18條IRAP引物對92份沙子空心李進行PCR分析，結果（表4）顯示，18條IRAP引物共擴增出189個位點，其中多態性位點180個，平均多態性位點比率為95.24%。18條引物的有效擴增位點數4～17，平均每個引物擴增10.5個位點，其中引物Ty3-2擴增出的位點數目最多，共17個，而Ty3-14擴增位點數則最少，僅4個；另外，種質N39擴增出的位點數最多，為118個，種質N10擴增出的位點數則最少，共47個。18條IRAP引物中多態性位點比例達到100%的共有12條，表明這些引物具有較高的多態性，能夠鑒別沙子空心李。引物Ty3-2及Ty3-6對92份沙子空心李種質PCR擴增結果見圖3。

圖3 引物Ty3-2及Ty3-6 PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification results of Ty3-2 and Ty3-6

2.4 IRAP遺傳多樣性指數

通過Popgene 1.32對統計的0、1數據進行統計分析，結果（表4）顯示，單個引物的等位基因數為1.667（Ty1-17）～2.000，平均等位基因數1.930；有效等位基因數為1.046（Ty1-2）～1.647（Ty1-18），均值1.426；Nei’s基因多樣性指數變幅為0.041（Ty1-2）～0.379（Ty3-3），平均值0.261；Shannon信息指數變幅為0.089（Ty1-2）～0.563（Ty3-3），平均值0.405；4個遺傳參數中，引物Ty1-7、Ty1-18及Ty3-3等各項值均相對較高，而引物Ty1-2及Ty1-3則相對偏低。

表4 IRAP引物擴增結果統計Table 4 Statistics of IRAP primer amplification results

2.5 沙子空心李種質聚類分析

利用NTSYS 2.10e軟件計算供試種質的遺傳相似性系數（DICE系數）。92份沙子空心李種質兩兩之間的DICE系數變幅為0.417～0.830，平均0.681。在遺傳相似系數為0.645時，92份沙子空心李被聚類為4組（圖4），聚類到第1組的沙子空心李數量最多，包含30份沙子空心李種質，第2組最少，共14個種質，第3組和第4組分別有22個及26個種質。92份沙子空心李種質采自4個種植區，然而聚類結果并不呈現出相應的規律性，這可能是因為采樣區域地理間隔較小，栽培環境與技術差異較小，株系間基因交流頻繁，因而聚類結果不規律。但根據聚類結果，92份沙子空心李種質在遺傳相似系數為0.645時可被聚類為4組，這表明供試的沙子空心李種質可能來自4個不同品系。

圖4 92份沙子空心李聚類結果Fig.4 Dendrogram of 92 Shazikongxinli germplasms based on IRAP bands

2.6 分子指紋圖譜構建

利用18條IRAP引物對92份沙子空心李進行PCR擴增，獲得每個引物92個種質的0/1數據矩陣，這些0/1數據可作為供試空心李種質指紋圖譜或分子身份證構建的直接依據。為達到利用最少的引物鑒定盡量多種質的目的，通過對有效等位基因數達到2.000的12條IRAP引物的種質鑒別情況進行統計（表5），最終確定核心引物為Ty3-2，其鑒別率最高（90.22%），共能鑒定出83個供試種質，另有9個沙子空心李種質（N10、N16、N35、N36、L26、L27、S2、S6、S7）無法鑒別出來，需與其他引物組合進行鑒別。引物Ty3-6與Ty3-2組成1組核心引物，可鑒別出所有種質，構建高效的指紋圖譜。將表1中的4個采樣地（沿河縣南莊村、黎家寨、十二盤村及孫家寨）分別以數字1、2、3、4表示，同時12條IRAP引物依次以字母“A-L”表示（表5），直接以引物擴增出的0/1數值串構建指紋代碼。以種質N1和L1為例，N1指紋代碼為：1A01000000000110001I000000000101，第1位數字1代表采樣地1（沿河縣南莊村），A代表IRAP引 物Ty3-2，I表 示 引 物Ty3-6；L1指 紋 代 碼 為：2A01010001010011001I011010000101，第1位數字2代表采樣地2（沿河縣黎家寨），最終利用每個種質的指紋代碼，分別生成包含基本信息的條形碼和二維碼（圖5）。

表5 IRAP引物鑒別供試種質情況Table 5 The number of germplasms that can be identi?fied by IRAP primers

圖5 沙子空心李種質N1及L1分子身份證Fig.5 Prunus salicina Lindl. Shazikongxinli N1 and L1 molecular IDs

3 討論

3.1 IRAP體系優化

本研究通過L16（ 43） 正交試驗確定10 μL沙子空心李IRAP-PCR反應的最優體系，經反復試驗，認為Mix及IRAP引物含量是影響PCR結果優劣的主要影響因素。MIX和IRAP引物含量過低時，PCR擴增結果中條帶均較少且較為暗淡，易造成試驗誤差，影響試驗結果。但Mix和IRAP引物含量也不可太高，IRAP引物含量過高時，容易導致引物二聚體的產生，同時也會增加導致非特異擴增及錯配的可能性［17］，而Mix含量太高則會造成不必要的浪費，達不到經濟高效的目的；另外，循環次數也是影響PCR擴增結果的重要因素，循環次數與PCR產物濃度成正比，次數太少易導致產物含量太少，而循環次數太多也會導致非特異性產物的產生，循環次數一般選擇30～40次［18］。本試驗對10 μL IRAP-PCR反應體系進行了優化，經濟高效地保證了試驗結果的準確性。

3.2 指紋圖譜構建

目前構建指紋圖譜的方法相對較多，有直接根據條帶統計獲得的“0/1”數據作為構建指紋的代碼；還有從多個引物的擴增結果中選取穩定的特異條帶組成“0/1”數據構建指紋代碼；另外，還可將二進制的“0/1”數據轉變為十進制的數字形成代碼［18］。指紋圖譜和分子身份證的構建對于種質鑒別具有重要意義。本研究確定引物Ty3-2及Ty3-6作為種質鑒定及指紋圖譜構建的高效標記引物，并據此構建了供試種質的分子身份證。在構建的分子身份證中加入了種質的相關信息，包括栽培地、突出性狀等信息，可為后續沙子空心李育成品種的分子身份證構建及種質知識產權的保護提供參考。

3.3 沙子空心李遺傳多樣性及聚類分析

遺傳多樣性能夠反映出物種的遺傳背景及育種潛力，是作物種內和種群之間育種過程的基礎條件［19］。對沙子空心李種質進行遺傳多樣性分析，是種質資源鑒定、篩選的重要工作，也是培育優異種質的前提。李作為一種常見果樹，對于其遺傳多樣性的研究相對較多。王紅林等［20］通過SSR標記對16份貴州中晚熟李種質進行分析，平均Shannon多樣性指數（I）為1.59，認為這些李種質具有豐富的遺傳信息，這和魏瀟等［21］利用22對SSR引物分析17份南方李品種的多樣性結果類似（I=1.709）。左力輝等［22］也通過SSR標記檢測了24份中國李品種的遺傳多樣性（H=0.227 3，I=0.358 6）。陳紅等［23］則通過ISSR標記分析了48份李種質的多樣性水平，平均Nei’s遺傳多樣性指數（H）為0.345，平均Shannon多樣性指數（I）0.508。目前對單一李品種內的遺傳多樣性研究相對較少。Basilio等［24］以29份日本李核心種質為研究對象，通過11條ISSR引物評價其多樣性，結果顯示平均Nei’s遺傳多樣性指數（H）為0.15，平均Shannon多樣性指數（I）0.27。這低于本研究通過18條IRAP引物對92份沙子空心李的分析結果（H=0.261，I=0.405）。其可能與本試驗采用的分子標記檢測能力不同，所收集的種質樣本數量多等因素有關。另外，Guan等［25］通過9個IRAP標記檢測了268份柿種間和種內的多樣性水平（H=0.240，I=0.389），認為這些柿種質具有較為豐富的遺傳信息。本研究驗證了反轉錄轉座子標記在李植物遺傳多樣性分析的適用性，顯示IRAP標記即使在單一品種中也具有較高水平地檢測變異的能力，這可能與反轉錄轉座子在李中分布廣泛、在種內也具有豐富的序列和插入多態性等特性有關。在逆境條件下，反轉錄轉座子容易被激活產生新的插入突變，進行橫向、縱向傳遞［26］，因而相較于SSR、ISSR等標記用于種間系譜的研究，IRAP標記由于其標記性質，可能更適合用于栽培種內的變異檢測［5］，分析種內個體水平上的遺傳變異情況及親緣關系。

遺傳相似性系數是判斷物種間親緣關系及遺傳基礎的標準之一［27］。本研究通過neighbor-joining法對92份供試沙子空心李進行聚類分析，在遺傳相似系數為0.645時，供試種質被聚類為4類。在聚類結果中這些供試種質并不呈現出相應的地理分布規律性，這可能是因為采樣的4個區域地理間隔較小，種苗來源途徑基本相同，栽培環境及技術等相近，同時種質間交流頻繁，滲入程度較大。本研究結果確定了供試種質基因水平上的親緣關系，可為后續選育優異種質中高效選配親本提供參考依據。

沙子空心李在生產上出現果實品質及成熟期不一致的現象，可能是在長期的栽培過程中，由地方品種的種性退化以及苗木繁育過程中產生的不同品系混雜引起的。本研究驗證了沙子空心李種質在DNA水平上產生了較為明顯的變異，排除了供試沙子空心李不同株系間在栽培表現上產生差異僅由環境因素或栽培技術不同而導致的情況，表明這些種質可作為優異品系培育的核心種質。后續可通過結合各個株系的優良性狀包括抗逆能力、果實品質、產量等進行雜交選配，培育出更為優異的后代。如利用沙子空心李種質N22具有果實最大的突出品質，結合N27果實口感最好和N7等種質高產、穩定的優點進行雜交后連續回交繁育后代，實現沙子空心李的增產提質。