百脈根不定根發(fā)育相關(guān)基因LcC2DP1的克隆與功能初步分析

馬思宇，肖芳斌，羅雪，韋飄，宋莉

貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)550025

植物根系具有固持地上組織和吸收水分、養(yǎng)分的雙重功能［1］，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用［2］。根系的生長(zhǎng)狀態(tài)和分化速度直接影響牧草的長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量［3-4］。牧草根系的發(fā)育受多種內(nèi)外環(huán)境因子的影響，由蛋白激酶（protein kinases， PK）介導(dǎo)的激素信號(hào)途徑是其中的主要調(diào)控途徑［5-6］。蛋白激酶是催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶，廣泛參與細(xì)胞信號(hào)感知［7］、傳導(dǎo)［8］、基因表達(dá)［9］、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控［10］等過(guò)程。根據(jù)催化域氨基酸序列的不同，蛋白激酶分為AGC、CaMK、CMGC、PTK和其他共5個(gè)類型［11］。CaMK中的C2鈣依賴蛋白激酶（C2 calciumdependent protein kinase， C2CDPK）是一類含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白。鈣依賴蛋白激酶（CDPK）依賴于Ca2+催化磷酸化反應(yīng)［12］，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程［13］。研究表明，CDPK參與植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，定位于細(xì)胞膜的擬南芥CDPK編碼基因CPK29參與側(cè)根形成調(diào)控［9］，苜蓿MtCDPK1表達(dá)促進(jìn)根毛的正常生長(zhǎng)［14］，水稻OsCDPK5在淹水條件下能保證根系通氣組織的正常形成［15］。C2結(jié)構(gòu)域蛋白主要定位于人類和動(dòng)物的細(xì)胞膜系統(tǒng)，具有參與磷脂第二信號(hào)產(chǎn)生、GTP酶激活和控制蛋白質(zhì)磷酸化等重要功能［16-17］。近年來(lái)，植物C2CDPK的研究已逐漸受到關(guān)注［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)小麥的C2CDPK基因TaC2DP1在干旱、低溫和熱脅迫中發(fā)揮重要作用［20］，旋蒴苣苔的BhC2DP1基因參與脫落酸（ab?scisic acid， ABA）信號(hào)途徑調(diào)控根的生長(zhǎng)［21］。盡管如此，人們對(duì)植物C2CDPK的了解仍極為有限。

百脈根（Lotus corniculatusL.）是一種優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草，也是一種良好的蜜源和護(hù)坡固土植物，其由匍匐莖發(fā)生的不定根所構(gòu)成的根系系統(tǒng)十分發(fā)達(dá)。本研究通過(guò)RACE擴(kuò)增法克隆Leo百脈根C2CDPK編碼基因LcC2DP1，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)該基因的組織表達(dá)特異性，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其不定根分化調(diào)控功能進(jìn)行初步分析，以期為揭示百脈根根系發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用植物材料為百脈根（Lotus corniculatus‘Leo’），種植于貴州大學(xué)貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)田。農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101和pSH737植物表達(dá)載體均保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。

1.2 LcC2DP1基因克隆

筆者所在課題組前期分析百脈根不定根發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［22］中發(fā)現(xiàn)，12個(gè)C2結(jié)構(gòu)域激酶基因家族成員在不定根發(fā)育過(guò)程中持續(xù)上調(diào)表達(dá)，其中的LcC2DP1（Lc1g3v0026680）表達(dá)最為顯著，本研究對(duì)該基因進(jìn)行進(jìn)一步研究，克隆引物（表1）采用Prim?er Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，提取百脈根莖、葉、根的總RNA混合反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，按照5′RACE和3′RACE試劑盒（TaKaRa， 大連）提供的操作方法進(jìn)行兩輪巢式PCR擴(kuò)增，首輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍后取1 μL作為第二輪PCR的模板。50 μL反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL、引物各2 μL、Taq酶0.5 μL、Buffer 5 μL、2H2O補(bǔ)足體系；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)后再72 ℃ 延伸10 min，之后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠分離和回收測(cè)序。根據(jù)已知序列和5′ RACE、3′ RACE測(cè)序結(jié)果，拼接目的基因全長(zhǎng)序列，分析起始和終止密碼子位置。根據(jù)RACE擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)2條全長(zhǎng)擴(kuò)增特異性引物（表1），以百脈根cDNA為模板擴(kuò)增LcC2DP1基因，擴(kuò)增條件為：94 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，68 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 延伸10 min。PCR擴(kuò)增片段與pMD18T載體連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后送生工生物一程（上海）公司測(cè)序。

表1 RACE和全長(zhǎng)基因克隆擴(kuò)增引物序列Table 1 RACE and full length gene cloning amplification primer sequence

1.3 LcC2DP1基因結(jié)構(gòu)分析

使用相關(guān)的生物信息分析在線工具進(jìn)行LcC2DP1基因的分子特征分析，其中，理化性質(zhì)（蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、分子式）采用ExPASy Prot?Param tool（https：//web.expasy.org/protparam/）、編碼蛋白的親疏水性采用Protscale（https：∥web．ex?pasy．org/protscale/）、蛋白結(jié)構(gòu)分析采用SOPMA（https：∥npsa-prabi．ibcp．fr/cgi-bin/）和SWISSMODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行。利用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bio?inf/plant-multi/）對(duì)LcC2DP1基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用BEDTools［23］獲得LcC2DP1基因上游2 000 bp序列（Lotus corniculatusgenome assembly build 3.0）［24］，利用在線網(wǎng)站PlantCARE對(duì)獲得的序列和順式作用元件進(jìn)行分析。使用NCBI的BLAST工具篩選出LcC2DP1同源序列后用MEGA X中鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.4 LcC2DP1基因表達(dá)分析

為探究LcC2DP1在百脈根不同組織和不同時(shí)期中的表達(dá)情況，分別收集Leo百脈根的根、莖、葉以及不定根形成過(guò)程中0、3、6、9、12 d根部組織為樣本。以百脈根UBI（DQ249171.1）作為內(nèi)參基因，通過(guò)IDT（https：//sg.idtdna.com/site/home/home/ses?siontimeout）在線軟件設(shè)計(jì)LcC2DP1和UBI的擴(kuò)增引物（表2）。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96）檢測(cè)LcC2DP1基因的時(shí)空表達(dá)特性，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序根據(jù)TIANGEN miRcutemiRNA試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。采用2-△△Ct方法［25］分析基因相對(duì)表達(dá)量。

表2 qRT-PCR檢測(cè)引物序列Table 2 Primer sequence used in qRT-PCR detection

1.5 植物表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ（TaKaRa， 大連）分別酶切pSH737和pMD18T- LcC2DP1質(zhì)粒，酶切片段回收后用T4DNA連接酶（TaKaRa，大連）4 ℃連接過(guò)夜，構(gòu)建LcC2DP1基因的植物表達(dá)載體，該基因由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，以GUS：：NPTII作為報(bào)告基因和篩選基因。采用YEP液體培養(yǎng)基培別采用GUS組織化學(xué)染色和RT-PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)化鑒定。采用視顯微鏡（OOX-86）進(jìn)行拍照，利用根系掃描儀（Epson）和根系分析軟件（Win Rhizo）對(duì)總根長(zhǎng)、根尖數(shù)、根系總表面積、根體積和根平均直徑等根系指標(biāo)進(jìn)行觀察及統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和顯著性分析分別采用Excel 2016軟件和DPS 7.05軟件，并采用GraphPad Prism 8.2軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

養(yǎng)所獲得的陽(yáng)性工程菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。參照楊少彤等［26］的方法，通過(guò)真空滲透法進(jìn)行百脈根枝條瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化條件為在12 kPa處理10 min，快速釋放壓力，再次重復(fù)處理1次。每組15株樣品，重復(fù)3次。以攜帶GV3101-pSH737質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植株作為對(duì)照，分

2.1 LcC2DP1基因克隆

基于百脈根不定根分化轉(zhuǎn)錄組篩選的Lc1g3v00 26680序列，對(duì)LcC2DP1基因進(jìn)行RACE擴(kuò)增，獲得的LcC2DP1全長(zhǎng)為705 bp，編碼235個(gè)氨基酸，該序列上游有起始密碼子ATG，下游有終止密碼子TGA。為了驗(yàn)證拼接序列的正確性，設(shè)計(jì)引物對(duì)LcC2DP1編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，得到1條約700 bp的特異性條帶，序列測(cè)定結(jié)果表明LcC2DP1編碼區(qū)與拼接結(jié)果序列完全一致（圖1）。

圖1 LcC2DP1基因克隆及拼接翻譯Fig.1 LcC2DP1 gene amplification and mosaic translation

2.2 LcC2DP1的理化性質(zhì)

對(duì)LcC2DP1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，其編碼蛋白含235個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為25 952.03，理論等電點(diǎn)為7.17，分子式為C1185H1737N305O344S6，脂肪指數(shù)為53.91，不穩(wěn)定性指數(shù)為85.47，是一種不穩(wěn)定蛋白。對(duì)LcC2DP1蛋白質(zhì)進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)其親水性氨基酸較疏水性氨基酸多（圖2A），推測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白。在LcC2DP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋有19個(gè)氨基酸（占8.15%），無(wú)規(guī)卷曲有175個(gè)氨基酸（占75.11%），延伸鏈有39個(gè)氨基酸（占16.74%）（圖2B），可確定該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)卷曲為主。利用Plant-mPLoc在線分析軟件，對(duì)LcC2DP1進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，LcC2DP1定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上（圖2C）。用Swiss model對(duì)LcC2DP1蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，LcC2DP1蛋白結(jié)構(gòu)包含大量的無(wú)規(guī)卷曲（圖2D），這與預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。對(duì)LcC2DP1的全長(zhǎng)蛋白序列進(jìn)行Blast比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，LcC2DP1與蒺藜苜蓿蛋白同源性最高，為82%（圖2E），暗示C2結(jié)構(gòu)域在豆科植物中進(jìn)化較為保守。

圖2 LcC2DP1 基因分子特性Fig.2 Molecular characteristics of LcC2DP1 gene

2.3 順式作用元件類型

提取百脈根LcC2DP1基因上游2 000 bp序列進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果（表3）顯示，百脈根LcC2DP1基因除了含有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域最基本的CAAT-box元件以外，還含有光響應(yīng)元件（Box-4、AT1-motif、GT1-motif）、轉(zhuǎn)錄起始核心啟動(dòng)子元件（TATA-box）以及干旱誘導(dǎo)相關(guān)（MBS）的多種順式作用元件。

2.4 植物表達(dá)載體構(gòu)建

擴(kuò)增LcC2DP1基因片段，與pSH737植物表達(dá)載體連接，雙酶切鑒定結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)705 bp的目的基因條帶（圖3A）。GV3103農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌株的PCR擴(kuò)增檢測(cè)顯示，菌體中能擴(kuò)增出705 bp的LcC2DP1基因條帶（圖3B），表明植物表達(dá)載體pSHLcC2DP1和攜帶LcC2CDP1基因的工程菌構(gòu)建成功。

圖3 植物表達(dá)載體雙酶切及農(nóng)桿菌PCR電泳檢測(cè)Fig.3 The electrophoretic detection on double enzyme digestion of plant expression vector and PCR of Agrobacterium tumefaciens liquid

表 3 LcC2DP1基因的主要順式調(diào)控元件Table 3 The main cis-regulatory elements of LcC2DP1 gene

2.5 LcC2DP1基因的表達(dá)特征

通過(guò)qRT-PCR分析LcC2DP1基因在百脈根不同組織及不定根分化期間的差異表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)相較于內(nèi)參基因UBI，LcC2DP1基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，但主要表達(dá)部位為根（1.00±0.00）和莖（7.57±0.36），在葉中表達(dá)量（0.15±0.03）最低（圖4A）。當(dāng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后，LcC2DP1基因在百脈根根（相對(duì)表達(dá)量為6.51±0.32）、莖（相對(duì)表達(dá)量為9.65±0.35）、葉（相對(duì)表達(dá)量為0.34±0.06）中表達(dá)量均增加，以根中表達(dá)變化量最為顯著（P<0.01）（圖4A）；不定根分化的0～9 d，野生型植株（WT）和轉(zhuǎn)LcC2DP1植株（TP）的LcC2DP1基因表達(dá)量均逐漸上升，但TP相較于WT變化顯著（P<0.05），其中3 d時(shí)為1.26±0.09，9 d時(shí)表達(dá)量最高（2.68±0.35），之后表達(dá)量下降，TP同期表達(dá)量均高于WT（圖4B）。

圖4 LcC2DP1 基因表達(dá)特異性Fig.4 LcC2DP1 gene expression specificity

2.6 LcC2DP1基因在不定根分化中的作用

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法將植物表達(dá)載體pSHLcC2DP1轉(zhuǎn)化到百脈根中。GUS組織化學(xué)染色顯示，外源基因轉(zhuǎn)化后3～15 d均可觀察到百脈根葉片顯示藍(lán)色，外源基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化百脈根后可在葉片和根部組織有效表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)藍(lán)色逐漸加深，到第9天時(shí)藍(lán)色最深（圖5A），之后藍(lán)色逐漸變淺，外源基因功能鑒定可在轉(zhuǎn)化后15 d內(nèi)進(jìn)行。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)第6天時(shí)不定根形成，之后根系逐漸增多（圖5B），利用RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)化后9 dLcC2DP1基因轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)外源基因有表達(dá)（圖5C）。

圖5 不定根分化9天時(shí)的轉(zhuǎn)基因植株觀察與鑒定Fig. 5 Observation and identification of transgenic plants after adventitious root differentiation for 9 days

由圖6可見(jiàn)，TP植株在第6天時(shí)觀察到不定根開(kāi)始分化，比野生型親本（WT）提前1～2 d形成根系。在第12～15天TP植株根系總根長(zhǎng)、根尖數(shù)、根體積均顯著高于WT植株。12 d時(shí)TP植株根系總根 長(zhǎng)為（4.28±0.22） cm，是WT的168%，15 d為（7.74±0.23） cm，是WT的155%（圖6A）；12 d時(shí)TP植株根體積為（0.016 7±0.001 2） cm3，是WT的249%，15 d時(shí) 為（0.040 3±0.003） cm3，是WT的161%（圖6B）；12 d時(shí)TP植株根尖數(shù)為（8.30±0.88） ，是WT的156%，15 d天時(shí)為（12.33±0.88），是WT的137%（圖6C）。同一時(shí)期的TP與WT的根系總表面積（圖6D）和根平均直徑（圖6E）差異不顯著。TP百脈根在總根長(zhǎng)（P<0.01）、根體積（P<0.05）和根尖數(shù)（P<0.05）上表現(xiàn)出一定的根系發(fā)育優(yōu)勢(shì)，LcC2DP1基因的表達(dá)可能與百脈根的不定根發(fā)育有關(guān)。

圖6 百脈根不定根分化9～15 d期間的根系發(fā)育指標(biāo)比較Fig.6 Comparison of root development indicators of the Lotus corniculatus during 9-15 days

3 討論

C2結(jié)構(gòu)域蛋白作為與鈣離子結(jié)合的一類功能型蛋白，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要的作用。本研究從Leo百脈根中克隆了LcC2DP1基因，序列分析發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的C2結(jié)構(gòu)域，屬于C2域蛋白家族基因［22，27］。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，LcC2DP1蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中，符合大多數(shù)C2結(jié)構(gòu)域蛋白的亞細(xì)胞定位情況［10］，這是由C2結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)構(gòu)所決定的，當(dāng)C2結(jié)構(gòu)域蛋白的N端發(fā)生酰基化修飾時(shí)，其棕櫚酰化位點(diǎn)可與細(xì)胞膜形成一種可逆的穩(wěn)定結(jié)合，而其豆蔻酰化位點(diǎn)則形成一種不可逆的松散結(jié)合［28］。

系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)LcC2DP1基因與狹葉羽扇豆、蒺藜苜蓿、刺毛黧豆等豆科植物具有較高的同源性，其中與蒺藜苜蓿的同源性最高為82%，說(shuō)明LcC2DP1在豆科植物中具有較高的保守性。對(duì)該基因進(jìn)行的組織特異性表達(dá)分析表明，LcC2DP1基因在百脈根牧草的根、莖和葉片組織中均有表達(dá)，但這種組織表達(dá)存在著明顯的差異，以根和莖組織中的表達(dá)量較高，而葉片中的表達(dá)量較低。馬佛明等［29］研究表明，巴西橡膠樹的C2結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因HbC2在被檢植物組織中均有表達(dá)；但辣椒C2結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因CaSRC2-1Kim卻具有顯著的組織特異性，僅在根組織中表達(dá)［30］。可以看出，C2結(jié)構(gòu)域蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育中有著不同的表達(dá)模式，暗示C2結(jié)構(gòu)域蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中功能的多樣性，包括可能參與根系發(fā)育調(diào)控過(guò)程。

張?zhí)m軍等［21］研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇植物旋蒴苣苔的C2CDPK蛋白基因BhC2DP1參與激素途徑調(diào)控根系發(fā)育。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)LcC2DP1基因功能進(jìn)行初步分析，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)LcC2DP1基因植株的不定根分化比野生型早1～2 d，且根系總根長(zhǎng)（P<0.01）、根體積（P<0.05）、根尖數(shù)（P<0.05）均高于野生型，LcC2DP1基因表達(dá)使宿主植物產(chǎn)生一定的根系發(fā)育優(yōu)勢(shì)，這加深了人們對(duì)植物C2CDPK基因功能的認(rèn)識(shí)。C2結(jié)構(gòu)域蛋白可以通過(guò)生長(zhǎng)素途徑調(diào)控根系發(fā)育［10，31］，本研究中的根系發(fā)育優(yōu)勢(shì)可能與激素途徑有關(guān)。光是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素之一，光通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和酶的活性等方式影響了植物的生長(zhǎng)發(fā)育和根系分化過(guò)程［32］，LcC2DP1基因順式作用元件中含有光響應(yīng)元件Box-4、AT1-motif和GT1-motif，該基因也有可能是通過(guò)響應(yīng)或改變光的敏感性調(diào)控植株生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而影響根系分化。

本研究通過(guò)對(duì)LcC2DP1基因的克隆、生物信息學(xué)分析、組織特異性表達(dá)、瞬時(shí)表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)LcC2DP1基因?qū)儆贑2蛋白基因，可能參與百脈根不定根發(fā)育調(diào)控過(guò)程，在后續(xù)的研究中，將進(jìn)一步驗(yàn)證LcC2DP1是否具有鈣依賴蛋白激酶相應(yīng)的生理功能，進(jìn)行百脈根穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化和創(chuàng)制突變體植株，明確LcC2DP1基因在不定根發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能。