非編碼RNA在骨關節炎中的研究進展

李震，李澤暉，孫赫，魏錦強，曾憲中，王小超，萬超，曹學偉*

(1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405；2.廣東省中醫院，廣東 廣州 510120；3.香港中文大學，香港 999077)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種與年齡相關的慢性、進行性和退行性關節疾病，影響著全球數以千萬計的中老年患者[1]。其主要特征包括關節軟骨退化、軟骨下骨增厚、滑膜炎癥和骨贅形成，主要癥狀是疼痛、僵硬和活動受限[1-2]。它不僅給患者帶來了巨大的痛苦，降低患者的生活質量，而且增加了社會經濟負擔[3]。近年研究對OA表觀遺傳調控機制的關注，揭示了非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)在調節軟骨細胞與細胞外基質平衡方面的潛在重要作用。

其中，微小RNA(microRNA，miRNA)是一種小單鏈ncRNA分子，通常長22～24個核苷酸，通過與靶基因的3'-UTR結合參與RNA沉默和轉錄后基因表達調控，導致信使RNA(messenger RNA，mRNA)降解增加或最終抑制蛋白質合成[4]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)為長度超過200個核苷酸的由RNA聚合酶Ⅱ合成的ncRNA，幾乎沒有蛋白質編碼潛力[5]。環狀RNA(circular RNA，circRNA)作為一種新型的ncRNA，由特殊的前體mRNA通過可變剪接產生的，廣泛存在于原核生物和真核生物中，為不具3'和5'末端頭尾的共價閉環結構，在生物體中穩定表達[6]。大量研究證實[5-7]，ncRNA(miRNA、LncRNA和circRNA)在轉錄、轉錄后和翻譯后水平的各種生物過程的調控中發揮著重要作用。值得注意的是，ncRNAs的變化參與了軟骨細胞炎癥、凋亡和細胞外基質代謝的調節，在OA的發生發展過程中也起著重要的作用。本文總結了導致OA發展的ncRNA調控機制的最新研究進展，將為闡明OA的發生發展提供更全面的依據。

1 miRNAs與OA

miRNA是研究最廣泛的ncRNA類別，其特征是不斷增加的22～24個核苷酸長的非蛋白質編碼RNA。miRNA通過與靶基因mRNA的互補堿基配對來調節其靶基因的表達。大量研究揭示了OA發病期間軟骨細胞中miRNA的異常水平，其中大多數在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平上功能性地參與軟骨細胞的炎癥反應、凋亡和基質代謝。

1.1 miRNAs調控OA中的炎癥 Chang等[8]報道在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的ATDC5細胞中，miR-486-5p上調，紅細胞衍生核因子2相關因子1(nuclear factor erythroid 2 like 1，NRF1)下調。miR-486-5p被驗證直接靶向和調節NRF1的表達。抑制miR-486-5p可顯著改善細胞增殖，減少細胞凋亡，減弱炎性細胞因子的產生，調節超氧化物歧化酶和乳酸脫氫酶的水平。此外，隨著NRF1的下調，miR-486-5p對LPS誘導的細胞損傷的影響減弱。總之，抑制miR-486-5p通過靶向NRF1減輕了LPS誘導的ATDC5細胞損傷，包括炎癥損傷、氧化應激和細胞凋亡。因此，NRF1可以作為OA的新治療靶點。Jiang等[9]研究發現，山奈酚通過下調miR-146a保護ATDC5軟骨細胞免受LPS引發的炎癥損傷。Jin等[10]發現miR-467b過表達顯著降低了LPS處理誘導的白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的產生，但被信號轉導和轉錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)的過表達逆轉，說明miR-467b通過靶向ATDC5細胞中的STAT1減輕LPS誘導的炎癥。Xiao等[11]報道miR-613通過靶向纖連蛋白1減輕IL-1β誘導的軟骨CHON-001細胞的損傷，因此，miR-613可能是治療OA的潛在選擇。Zhang等[12]發現miR-130b在骨髓間充質干細胞和OA軟骨細胞的軟骨分化過程中分別首先增加和急劇減少，而IL-1β刺激導致軟骨細胞中miR-130b表達增加。miR-130b抑制劑促進骨髓間充質干細胞的軟骨分化和軟骨細胞生長并抑制炎癥因子的水平。以上研究均表明，miRNAs多與其靶基因形成調控軸，通過減弱炎性細胞因子的產生、促進細胞增殖及抑制凋亡等途徑參與調節OA中的炎癥反應。

1.2 miRNAs調控OA中的細胞凋亡 Wan等[13]發現，miR-152的上調提高了軟骨細胞的活力，減少了細胞凋亡并平衡了體外細胞外基質的分解代謝和合成代謝因子，生物信息學分析表明轉錄因子-4(transcription factor-4，TCF-4)是miR-152的靶基因，因此，miR-152通過TCF-4通路減弱骨關節炎大鼠軟骨細胞凋亡和軟骨退化。Wen等[14]報道，miR-455-3p通過調節磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl alcohol kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路減少細胞凋亡并減輕軟骨細胞變性。Chen等[15]報道miR-129-3p通過靶向胞質多聚腺苷酸化成分結合蛋白1(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1，CPEB1)減輕膝關節骨折誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡。Sun等[16]報道miR-93-5p在OA中下調可能通過靶向LncRNA腫瘤易感性候選基因2(long non-coding RNA cancer susceptibility candidate 2，LncRNA CASC2)抑制LPS誘導的軟骨細胞凋亡。調控細胞凋亡的基因數量眾多，調控網絡中任何關鍵節點的變化都可能影響最終細胞凋亡的產生和發展，miRNAs能夠直接靶向調控凋亡因子的表達，影響細胞凋亡進程。一些miRNAs主要作用于促凋亡基因對凋亡產生抑制作用，而另外一些miRNAs則針對性地負調控凋亡基因促進細胞的凋亡。

1.3 miRNAs調控OA中的細胞外基質(extracellular matrix，ECM) Bai等[17]研究發現miR-122的過表達增加了ECM分解代謝因子的表達，并抑制合成代謝基因的表達；miR-122表達的抑制具有相反的效果。此外，沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)被確定為miR-122的直接靶標。因此，miR-122/SIRT1軸調節骨關節炎中軟骨細胞的細胞外基質降解。Xiang等[18]發現miR-142-5p的過表達通過抑制軟骨細胞凋亡減輕了OA病理，即使在CXC族趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)過表達的OA軟骨細胞中也是如此。這與軟骨基質降解減少、軟骨炎癥減少和有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路失活有關。因此，CXCR4靶向miR-142-5p的上調表達可以抑制OA軟骨細胞的細胞凋亡、炎癥和基質分解代謝，并使MAPK信號通路失活。An等[19]報道miR-203a的下調通過Smad3信號傳導抑制人軟骨細胞中IL-1β誘導的炎癥和軟骨降解。Tu等[20]發現miRNA-377-3p通過下調整合素α6(integrin α6，ITGA6)減輕IL-1β引起的骨關節炎軟骨細胞凋亡和軟骨降解。在生理情況下，軟骨細胞基質合成與分解代謝動態平衡的細胞因子可通過調控軟骨細胞生理功能，參與免疫應答和介導炎性反應等。當關節軟骨損傷時，炎性信號通路被激活，導致炎性因子IL-1β、TNF-α、轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等激活ECM降解酶，如：基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS)等，參與軟骨基質Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的降解，從而促進OA的進展。

相關研究表明，miRNA調控網絡在表觀遺傳學、相關靶基因的表達、細胞通路等方面起著重要作用。大量研究證實在OA病理進程中，miRNA表達譜會發生變化，從而發揮不同的調控作用。本課題組前期高通量測序結果顯示，OA患者軟骨細胞中有53個表達異常的基因，其中34個上調，如：miR-3622b-3p、miR-129-2-3p和miR-585-3p等；19個下調，如miR-383-5p、miR-548ap-3p和miR-378e等。關節液中穩定存在的miRNA，具有成為診斷OA的生物學標志物的巨大潛力。有體內外研究證實，通過干預miRNA可以抑制軟骨退變，因此其可作為OA的潛在治療靶點。隨著對miRNA不斷深入的研究，一定可以大大推動OA的診斷和治療。

2 IncRNA與OA

LncRNA是一種長度超過200個核苷酸的非編碼轉錄物，其異常表達與多種人類疾病有關。在OA的發展過程中，IncRNA可通過招募相關蛋白調控基因轉錄、參與調控細胞信號通路、作為競爭性內源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)靶向相關miRNA或直接靶向mRNA等方式發揮調控作用。

2.1 IncRNA調控OA中的炎癥 在早期階段，OA已經具有不同程度的炎癥性表現。Luo等[21]研究發現MFI2-AS1的敲低通過增加miR-130a-3p和減少TCF-4增加了細胞活力，但抑制了LPS處理的軟骨細胞的細胞凋亡、炎癥反應和細胞外基質降解。表明敲低LncRNA MFI2-AS1通過miR-130a-3p/TCF-4抑制LPS誘導的骨關節炎進展。Wang等[22]發現LncRNA THUMPD3-AS1的過表達減輕了細胞凋亡并促進了炎癥反應，而敲低具有相反的效果LncRNA THUMPD3-AS1顯著增加細胞周期蛋白E2、細胞周期蛋白依賴性激酶4、B細胞淋巴瘤2、TNF-α、一氧化氮和IL-6水平，并降低caspase-3水平。Zhang等[23]報道miR-6891-3p通過靶向Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)抑制巨噬細胞增殖、遷移和炎癥反應，而LncRNA IGHCγ1通過巨噬細胞中的核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號作為miR-6891-3p的ceRNA促進TLR4表達。表明LncRNA IGHCγ1通過調節巨噬細胞中的miR-6891-3p/TLR4/NF-κB軸來調節炎癥反應。Xie等[24]發現在C28/I2細胞中，母本表達的8個小核仁RNA宿主基因(maternally expressed 8，small nucleolar RNA host gene，MEG8)表達的沉默顯著觸發了IL-1β誘導的增殖抑制、細胞死亡和炎癥反應。然而，轉染MEG8顯示出不利影響，說明LncRNA MEG8在骨關節炎中下調并調節軟骨細胞增殖、凋亡和炎癥。炎癥是OA關節疾病的重要標志，隨著對OA的進一步研究，LncRNA廣泛參與其炎癥信號通路的全過程，且在骨關節組織中呈差異表達。

2.2 IncRNA調控OA中的細胞凋亡 Fan等[25]研究發現與使用小干擾RNA陰性對照(si-NC)轉染相比，LINC00473敲低可顯著減少IL-1β刺激的C28/I2細胞中軟骨細胞凋亡和促炎細胞因子的產生。并且，LINC00473通過miR-424-5p/淋巴細胞抗原6復合物E(lymphocyte antigen 6 complex，locus E，LY6E)軸促進軟骨細胞凋亡和促炎細胞因子的產生，從而加劇骨關節炎的發展。Wang等[26]發現阻斷Lnc HOX通過調節miR-222/ADAM10軸保護人類軟骨細胞免受IL-1β誘導的細胞凋亡、ECM降解、炎癥反應和氧化應激。Zhang等[27]發現Lnc生長抑制特異性基因5(growth arrest-specific transcripts 5，GAS5)過表達增加了軟骨細胞中Smad4的表達。相比之下，miR-146a過表達下調了軟骨細胞中的Smad4。此外，Lnc GAS5和Smad4過表達抑制LPS誘導的軟骨細胞凋亡，而miR-146a過表達起相反的作用并減弱Lnc GAS5和Smad4過表達對細胞凋亡的影響。Nie等[28]發現LncRNA CALML3-AS1靶向miR-146a來調節軟骨細胞凋亡。Zhou等[29]發現LncRNA CASC19通過調節miR-152-3p/DEAD-box解旋酶6(DEAD-box helicase 6，DDX6)軸加速軟骨細胞凋亡和促炎細胞因子的產生以加劇骨關節炎的發展。

2.3 IncRNA調控OA中的ECM ECM具有保護軟骨細胞免受機械應力破壞的作用，其合成和分解代謝的動態平衡維持著正常關節的完整功能，而ECM代謝平衡依賴于各種細胞因子的調節。Chen等[30]研究發現SHNG15過表達顯著抑制ECM降解并促進OA軟骨細胞的軟骨細胞形成，LncRNA SNHG15通過調節細胞外基質穩態緩解骨關節炎進展。Chen等[31]發現LINC00671的過表達導致軟骨細胞增殖受抑制、細胞凋亡增強和ECM降解，這很容易通過沉默onecut2或smurf2來逆轉。此外，LINC00671通過smurf2誘導糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)泛素化并上調β-catenin表達。體內實驗表明LINC00671或GSK-3β激活劑的沉默導致ECM降解減輕并改善OA進展。Liu等[32]報道IncRNA核富集轉錄體1(nuclearenrichedabundanttranscript1，NEAT1)靶向miR-193a-3p，miR-193a-3p靶向性別決定區Y框蛋白5(sex determinant Y box protein 5，SOX5)。抑制miR-193a-3p可逆轉NEAT1介導的炎癥反應、細胞凋亡和細胞外基質的降解。SOX5消除了miR-193a-3p上調對軟骨細胞炎癥、細胞凋亡和細胞外基質產生的影響。總之，NEAT1/miR-193a-3p/SOX5軸調節人類OA中的軟骨基質降解。由此推斷，LncRNA對軟骨ECM起到重要調控作用，對OA患者關節的破壞密切相關。

綜上所述，LncRNA作為調節基因表達的研究熱點，可能通過調控軟骨細胞炎癥、細胞凋亡和軟骨基質代謝等對OA的發病進程發揮關鍵的調控作用。研究發現LncRNA在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平上的調控過程均發揮重要作用，進一步研究證實LncRNA的表達高低將影響OA的病理進程。深入的研究正在逐漸揭示數量龐大且功能復雜的IncRNA家族的面紗，但目前對其如何調控OA的具體作用機制仍然存在很多疑惑。因此，進一步探討LncRNAs在軟骨和OA中的調控作用至關重要，有助于開發其在OA診斷和治療方面的應用潛力。

3 circRNA與OA

circRNA是一類ncRNA，其特點是共價閉環結構，既沒有5'帽子結構，也沒有3'poly(A)結構。它們由前體mRNA的反剪產生，并在高度保守、穩定和組織特異性的哺乳動物中廣泛表達。最近的研究表明，circRNA可以競爭性地相互作用并抑制miRNA海綿在其下游功能中的作用。因此，circRNA的作用及其潛在的miRNA調節劑被用來描述OA的分子機制和治療OA的治療靶點。

3.1 circRNA調控OA中的炎癥 炎癥可以促進細胞軟骨的降解，加重骨關節炎患者的病情，傳統的炎癥因子主要有IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-6等，許多研究發現circRNAs調控骨關節炎進程與這些因子密切相關。circ_0128846沉默增強了細胞活力，但降低了細胞凋亡率和炎癥反應，這被miR-140-3p敲低逆轉。Janus蛋白酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)的過表達逆轉了miR-140-3p對細胞表型的影響。circ_0128846沉默通過上調OA細胞中的miR-140-3p和下調JAK2來抑制MMP-13的水平并促進II型膠原的表達。動物實驗結果表明，circ_0128846沉默通過調節 miR-140-3p/JAK2軸促進Ⅱ型膠原蛋白表達并減弱OA進展。circ_0128846通過充當miR-140-3p的海綿RNA來促進OA的發展，從而增加JAK2的表達。結果表明，靶向circ_0128846可能具有緩解OA進展的潛力[33]。Zheng等[34]研究發現circ_0116061和smurf2在OA軟骨組織中高表達，miR-200b-3p低表達。敲低circ_0116061可以促進OA軟骨細胞的增殖并抑制其凋亡和炎癥。miR-200b-3p可以被circ_0116061吸收，其抑制劑可以逆轉circ_0116061沉默對OA軟骨細胞生物學功能的調節。Smurf2是miR-200b-3p的靶標，其表達受circ_0116061的正調控。Smurf2的沉默還可以增強OA軟骨細胞的增殖并抑制其凋亡和炎癥。此外，smurf2過表達也可以逆轉circ_0116061沉默對OA軟骨細胞生物學功能的調節。所以，circRNA與OA炎癥的病理進程有著密切聯系。

3.2 circRNA調控OA中的細胞凋亡 Huang等[35]機制研究表明，circRNA_0092516與miR-337-3p結合，干擾circRNA_0092516通過miR-337-3p/蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)軸促進軟骨細胞增殖并抑制細胞凋亡，從而改善OA。體內實驗闡明circRNA_0092516通過miR-337-3p調控軟骨生成。總的來說，對circRNA_0092516的干擾通過miR-337-3p/PTEN軸促進了軟骨細胞增殖并抑制了細胞凋亡，最終減緩了OA的進展。Zhou等[36]研究發現環狀RNA circANKRD36通過靶向miR-599來調節Casz1以防止骨關節炎軟骨細胞凋亡和炎癥。Shi等[37]發現circSEC24A的過表達通過減少細胞增殖和增加軟骨細胞的凋亡和炎癥來促進IL-1β誘導的損傷。circSEC24A通過調節miR-142-5p/SOX5軸促進IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和炎癥。另外，circ_0134111敲低通過circ_0134111-miR-515-5p-SOCS1網絡減輕IL-1β誘導的人軟骨細胞凋亡、炎癥和細胞外基質降解[38]。

3.3 circRNA調控OA中的ECM Bai等[39]研究發現circTMBIM6和MMP-13在骨關節炎患者軟骨組織中的表達水平高于正常組，而miR-195在骨關節炎患者軟骨組織中的表達水平較低。IL-1β和TNF-α處理后，軟骨細胞中circTMBIM6和MMP-13的表達增加，而miR-27a的表達降低。circTMBIM6過表達降低了miR-27a的表達，但增加了MMP-13的表達。circTMBIM6基因敲除顯示出相反的效果。Zhang等[40]發現circSERPINE2過表達減輕了IL-1β引起的細胞凋亡和細胞外基質降解。miR-495被circSERPINE2靶向并在OA患者和IL-1β處理的軟骨細胞中上調。miR-495上調逆轉了circSERPINE2介導的細胞凋亡和細胞外基質降解抑制的過度表達。miR-495靶向轉化生長因子β受體2(transforming growth factor beta receptor 2，TGFBR2)，在OA患者和IL-1β處理的軟骨細胞中低表達。源自SERPINE2基因的circSERPINE2可以通過與miR-495結合介導TGFBR2表達。總之，circSERPINE2通過調節miR-495/TGFBR2軸減弱IL-1β引起的軟骨細胞凋亡和細胞外基質降解。

已有許多研究證實circRNA參與了OA密切相關的軟骨細胞EMC的降解、OA軟骨細胞的增殖、凋亡和自噬、OA軟骨細胞的炎癥反應等病理進程，這說明circRNAs有可能作為診斷和治療OA的新靶點。近幾年，circRNA已經成為各個學科領域研究的熱點，但是在骨關節炎病理進程中，是否伴隨特異性circRNA表達的調控，circRNA-miRNA-mRNA之間具體的調控網絡軸，LncRNA與circRNA之間的調控關系以及circRNA自身表達高低的調控機制都不明確，因此，進一步的研究探索circRNA的調控機制必不可少。

4 小結與展望

ncRNA在RNA中占有很大的比重，之前錯誤的認為ncRNA無實質性的功能，但是近年來隨著研究的不斷深入，越來越多的ncRNA被證實在生物體的生長、發育和病理過程中發揮著至關重要的作用。本研究綜述了近些年miRNA、LncRNA和circRNA在OA病理進程炎癥反應、細胞凋亡和細胞外基質中的重要調控作用，隨著研究的不斷深入及越來越多的新的ncRNA被發現，將對OA基因表達調控網絡的認識有了較大提升。大量的體內外研究已經證實在OA的病理進展中，許多ncRNA表達譜會發生顯著改變，并對OA的發展起到不同的調控作用，通過對ncRNA的干預可以影響疾病的進程，這可能成為未來逆轉OA進展的潛在治療方法。雖然，ncRNA的發現使人們對基因調控機制的認知更加清晰，但由于其具有高度的表達特異性使其作用機制多樣化。目前關于OA發病機制的研究仍處于初步探索階段，隨著ncRNA在OA的深入研究，闡明ncRNA在細胞中的分布，是否涉及上、下游拮抗劑協調作用為OA的診斷及潛在生物標志物或治療靶標提供新的思路。

總之，OA的發病機制受多種因素影響，眾多的ncRNA組成的調控網絡發揮的生物功能及調控機制極其復雜，目前尚不能詳細闡明ncRNA在OA中組成的調控網絡所發揮的生物學功能及調控機制。因此，進一步研究ncRNA在OA中的分子機制和作用，不斷闡明ncRNA的功能、ncRNA之間以及它們和DNA之間的相互作用，不僅可以加深對OA的發病和發展的認識，而且對于發現治療靶點和療效更好的藥物也具有重要意義。