PI3K/Akt/mTOR 通路與足細胞自噬在糖尿病腎病腎功能修復中的研究

陳 婷，劉金彥

（1.濟寧醫學院臨床醫學院，山東 濟寧 272067；2.濟寧市第一人民醫院腎內科，山東 濟寧 272011）

隨著肥胖、久坐以及高糖（hyperglycemia，HG）、高脂（hyperlipemia，HLP）等不良飲食習慣的改變及遺傳因素的影響，糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者群體不斷擴大[1，2]。DM 及其并發癥糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）的出現顯著增加了全身多臟器功能障礙以及衰竭的風險[3，4]。在營養物質代謝紊亂的環境下，PI3K/Akt/mTOR 為軸的信號通路可顯著激活自噬，促使足細胞為自身輸送能量，延長壽命，減少蛋白尿的流失[5]。本文對PI3K/Akt/mTOR信號通路下多種調節因子激活足細胞自噬的相關生化途徑進行綜述，為尋找未來治療的潛在靶點提供參考。

1 DKD 的概述

DKD 是DM 最為嚴重的并發癥之一，是終末期腎病的源頭所在，是進入腎臟替代治療的主要原因[6，7]。DM 病程、血糖控制情況、基礎疾病和遺傳因素是DKD 的驅動因素[8]。1 型和2 型糖尿病患者發生DKD 風險及病理生理機制基本相似，均需要10～20 年才能表現出來。近些年來，DM 及DKD 患病人數不斷擴大，長期HG 損害腎臟、心血管系統、神經、骨骼、眼等多個器官[9-11]。根據2020 年KDIGO 指南所述，DKD 的界定標準為尿蛋白排泄率持續升高≥30 mg/g，尿蛋白與尿肌酐的比值≥3 mg/mmol，或腎小球濾過率eGFR＜60 ml/（min·1.73 m2），或兩者兼有，持續3 個月以上[12]。近年來，DKD 患者出現了一種非蛋白尿CKD 表型，其特征是eGFR 逐漸降低，無蛋白尿的出現[13，14]。有研究[15，16]通過建立DKD發展為腎衰竭的預測模型，探究影響DKD 預后的因素，結果顯示較低的eGFR 與血紅蛋白含量、高胱抑素C 水平、中性粒細胞與淋巴細胞比率和24 h 尿蛋白顯著增加了DKD 患者接受腎臟替代治療的風險。此外，肥胖、高血壓、高尿酸與同型半胱氨酸血癥、HG、HLP 等代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）可加速腎臟超微結構發生改變[17-19]。

由內皮細胞和足細胞產生的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）異常周轉與修飾所致的腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）增厚是DKD 的早期病理改變；損傷的內皮細胞表面產生促凝、促血管收縮因子以及抗血管生成因子，粘附分子、血管生成因子及其受體減少，內皮祖細胞減少，內皮細胞大量凋亡與血管平滑肌細胞增殖引起進行性腎微血管性缺血，上述多種病理改變通常被認為是DKD 中足細胞激活的早期信號[20，21]。若上述過程未能給予早期干預，將發生不可逆轉的腎損害。Balmer LA 等[22]僅在HG 數天觀察到腎小管肥大，小管間質改變，隨著DKD 的進展，腎小管發生萎縮，小管間質纖維化改變，管周毛細血管稀疏。長期在HG 環境下，缺血缺氧促使足細胞發生代償性肥大，ECM 產生過多，系膜基質中的蛋白質發生非酶糖基化導致系膜基質擴張，腎小球毛細血管袢被粉紅色透明物質包圍形成腎小球內微動脈瘤，又稱Kimmelstiel Wilson（KW）結節，腎臟功能逐漸退化[17]。

2 足細胞損傷

腎小球濾過屏障是最復雜的生物膜，允許水分子通過，中小分子不能完全通過，白蛋白和大分子營養物質完全不能通過。足細胞是通過足突錨定在GBM 的外層的終末分化上皮細胞，參與構成濾過屏障，是減少蛋白尿產生的關鍵環節，一旦損傷，不可再生[23]。生理情況下，足細胞作為胰島素敏感細胞，可通過細胞膜表面的葡萄糖轉運體（glucose transporter，GLUTs）將葡萄糖轉移至細胞內。DKD 患者體內存在著廣泛的胰島素抵抗，HG 使GLUTs 數量難以代償性增加，葡萄糖向胞外轉運率降低，如多元醇通路通量、晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）大量蓄積、AGEs 受體及其活化配體表達升高、細胞內信號轉導遞質PKC 亞型的刺激和氨基己糖信號通路激活使得細胞內葡萄糖水平持續升高[24]。HG 與HLP 引起活性氧、糖化蛋白和氧化脂質等多種有害生化因子大量產生可直接激活補體系統，啟動促炎信號傳導[25，26]。血管內皮細胞對氧化應激的易感性增加，腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）激活、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、TGF-β/SMAD 通路等多種機制誘導促炎因子釋放[25]。線粒體穩態難以維持，細胞器的工作信號相互串擾，傳入與傳出小動脈玻璃樣變，腎小球血流動力學改變導致灌注不足，自我調節功能受損，腎小球微循環受阻，系膜基質、小管間質中的膠原蛋白、纖維連接蛋白等細胞外基質蛋白沉積，致使營養素信號傳遞及攝取中斷，能量代謝的平衡狀態被嚴重打破，足細胞發生凋亡[26，27]。Matsusaka T 等[28]通過體外試驗對足細胞損傷特點進行挖掘，結果顯示毒素蓄積導致的足細胞損傷，損傷的足細胞可釋放轉化生長因子、內皮素-1、趨化因子等多種有毒物質波及周圍的細胞，腎單位大量丟失。

3 足細胞自我保護機制

自噬是細胞對氧化應激、炎癥反應、營養缺乏等惡劣條件下作出的應激反應，分為巨噬、伴侶蛋白介導的自噬與微自噬三種模式，包括自噬誘導與自噬小體的形成等多個過程[29，30]。自噬程序的啟動可將胞內衰老受損的細胞器以及異常的大分子物質、病原體轉入溶酶體內降解，降解產物可作為能源物質被回收利用。這種自我清潔與能量循環的過程有利于節約外界能量供給，促進細胞生長發育，提高細胞生存適應性，保持細胞活力[31-33]。自噬周轉的相對速率反映自噬活性的高低，又被稱為自噬通量[34]。

mTOR 是自噬重要的調節因子，是一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸化酶，共分為兩種：mTOR 復合物1（mTORC1）和復合物2（mTORC2）[35]。mTORC1 是一種對RAPA 敏感的蛋白激酶復合物，由mTOR 調控相關蛋白（RAPTOR）、G 蛋白β-亞基樣蛋白（Gβl）等多種成分組成，通過感知葡萄糖、氨基酸、氧的水平，磷酸化p70、S6K1、4EBP1 等多種調節因子參與細胞周期與自噬進程，維持營養物質平衡[32]。mTORC2 對RAPA 的敏感性遠低于mTORC1，由mTOR、Gβ、對mTOR 的RAPA 不敏感的伴侶蛋白RICTOR 等成分組成，對生長因子敏感，負責細胞骨架的搭建[36]。

自噬程序的啟動受多種信號通路的調控，高度進化保守的自噬相關基因（autophagy-related gene，ATG）的表達決定了自噬通量的大小與底物降解的高度選擇性[37]。Audzeyenka I 等[36]通過實驗發現，長期暴露于HG 環境下，由于細胞對胰島素的敏感性被抑制，大鼠原代足細胞自噬相關基因Atg12-Atg5 表達減少，LC3-II、Beclin1 等自噬相關蛋白表達大幅度降低，自噬通量下調。mTORC1 抑制劑雷帕霉素（RAPA）是防止器官移植后臨床排斥反應的常用藥物，可特異性結合mTOR 激酶，抑制mTOR 活性[38，39]。Li Q 等[40]研究表明，AGEs 的積累抑制了足細胞對纖維連接蛋白的粘附與遷移，降低足細胞活力，提升凋亡水平。RAPA 的應用減少了HG 對足細胞的不利影響，而mTORC1 和mTORC2雙抑制劑KU0063794 的應用進一步增加了HG 環境足細胞存活的可能性。Fang L 等[41]使用自噬增強劑低劑量RAP（1 ng/ml）恢復自噬，雙免疫熒光染色顯示足細胞素表達減少，分布模式得到明顯改善，缺陷性自噬得以修復，濾過屏障功能受損得到緩解，因此恢復自噬活性可能是緩解足細胞損傷的新靶點。Yu S 等[42]也得出同樣的結論。

4 PI3K/Akt/mTOR 通路與足細胞自噬調節

生理狀態下，足細胞膜表面鑲嵌著大量生長因子受體與營養物質轉運通道蛋白。當機體血糖水平升高時，胰島素的分泌促進葡萄糖向細胞內轉運，推進氨基酸、脂質等營養素的生物合成，抑制糖異生，足細胞內外環境處于穩定狀態，以PI3K/Akt/mTOR通路為主軸的自噬機制往往不被激活而處于休眠狀態[43，44]。在DKD 患者體內，在足細胞長期處于HG、HLP 環境時，使抗氧化能力大大受限[48]，活性氧的誘導與內質網應激信號的表達、胰島素抵抗、營養物質代謝紊亂、毒素蓄積及激素的異常分泌、HG、HLP 刺激胰島素樣生長因子1（IGF-1）、胰高血糖素、一氧化氮（NO）、血管內皮生長因子（VEGF）和前列腺素等血管活性介質的釋放[21]。DKD 前期腎小球內部灌注不足，足細胞長期處于饑餓狀態，極易發生程序性死亡[40]。此時，能量感知因子與生長因子激活腦Ras同源蛋白（Rheb）開關，并與G 蛋白偶聯受體（GPCRs）、酪氨酸激酶受體（TKRs）結合，觸發磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、PI3K 下游的蛋白激酶B（Akt）的磷酸化，進而激活mTORC1 的組成成分4EBP1 與S6K1 誘導自噬[46]，胞內有益成分的繼續保留，異常免疫復合物及衰老損傷的細胞器及大分子物質降解，部分排出體外，部分合成核酸及其前體、蛋白質、脂質、ATP 和NADPH 等能源物質平衡細胞合成代謝與分解代謝[47]。mTORC2 位于Akt 的下游，磷酸化的Akt 啟動mTORC2 參與細胞骨架的搭建，與此同時，mTORC1 也得到了最大程度的激活，mTORC1 與mTORC2 二者相輔相成，共同減少胰島素抵抗誘導的細胞毒作用，實現細胞內營養物質的循環使用，細胞外源源不斷的能量供應與足細胞的自我修復[43]。

有研究顯示[48]，用正常培養液和無氨基酸培養液對足細胞進行體外培養，Western blot 檢測到LC3Ⅱ和beclin1 水平增加，逆轉錄-定量聚合酶鏈反應結果顯示LC3Ⅱ對應的mRNA 水平呈現上升趨勢，透射電鏡觀察自噬小體大量產生，由此可知：氨基酸饑餓（amino acid starvation，AAS）可促進核轉位，提高轉錄因子EB（TFEB）的活性，高活性的TFEB 可抑制mTOR，促進自噬體、自噬溶酶體的形成和底物降解。糖原合成酶激酶3β（GSK3β）作為糖原代謝的重要組成部分，已被證實為PI3K/Akt 通路的下游靶點，其活性與自噬呈負相關。

前期研究發現，肝細胞生長因子（HGF）通過抑制GSK3βHG 還原Ser9 磷酸化而增加自噬通量，因此Ser9 磷酸化是GSK3β 活化的指標。Hou B 等[49]評估HGF 在DKD 中足細胞穩態中的作用并進一步闡明其機制：對自噬相關蛋白和足細胞骨架蛋白--突觸素（Synapt）進行免疫熒光雙染色發現DKD 患者足細胞自噬通量受損。與未接受HGF 治療的DM 小鼠相比，接受HGF 治療的DM 小鼠的尿白蛋白排泄率、足細胞損失量顯著降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增加。HGF 的這些有益作用可被其抑制劑克唑替尼或PI3K 抑制劑LY294002 阻斷，與對照組相比，DKD小鼠組p-Akt（ser473）/Akt 和pGSK3β（ser9）/GSK3β比值降低。上述實驗證實HGF 在足細胞中通過PI3K/Akt-GSK3β-TFEB 軸改善溶酶體功能和自噬。表皮生長因子（EGF）已被認為是慢性腎臟疾病進展的潛在生物標志物，是典型的表皮生長因子受體（EGFR）配體，主要來源于腎臟。Sun Y 等[50]使用EGF 處理HG 刺激后的足細胞，DNA 甲基化表達譜分析顯示，與HG 組相比，HG+EGF 組有9309 個CpG 高甲基化位點（5220 個基因）和3111 個CpG低甲基化位點（2511 個基因），差異甲基化基因在PI3K/AKT/mTOR 信號通路中顯著富集，提示EGF介導的保護作用通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路中的相關DNA 甲基化參與腎足細胞的修復。

當HG 誘導的脂質蓄積超過細胞的代償能力時，對足細胞產生不可逆轉的損傷[51]。既往研究表明[52-54]，硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）參與調節細胞的糖、脂代謝。Du C等[55]研究了TXNIP 對DKD 中脂質積累的影響，與DM 野生型小鼠相比，敲除TXNIP 相關基因后，乙酰輔酶a 羧化酶、肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ等脂代謝相關酶以及Akt、mTOR 的表達減弱，小鼠體內脂質積聚增加。使用PI3K 特異性抑制劑LY294002 阻斷Akt/mTOR 信號通路，可以復制TXNIP 沉默的效果。因此，TXNIP 的存在可通過抑制Akt/mTOR 通路抑制自噬，加重脂質在腎臟中積聚。抑制TXNIP 的產生與釋放可能為足細胞損傷相關腎病患者提供新的希望。HG 可誘導足細胞中精子相關抗原5（SPAG5）的mRNA 和相應蛋白表達上調，沉默SPAG5 可逆轉HG 處理的足細胞凋亡小體與自噬小體減少的狀況[56-58]。Xu J 等[59]發現SPAG5-as1 作為SPAG5 的鄰居基因，與泛素特異性肽酶14（USP14）相互作用，使SPAG5 蛋白去泛素化并趨于穩定狀態。因此，當SPAG5-as1 作用于SPAG5/AKT/mTOR 通路時，對足細胞自噬具有抑制作用，加劇足細胞凋亡。靶向調節SPAG5-as1/SPAG5 激活自噬為緩解足細胞損傷提供一種新的治療選擇。

含SH2 結構域的肌醇5'-磷酸酶（SHIP）被稱為PI3K/Akt 通路的負調控因子[60]。Li F 等[61]研究發現，在DKD 小鼠體內，HG 以時間依賴性的方式降低了SHIP 的表達，同時激活了PI3K/Akt 信號通路導致ECM 的產生，而轉染M90-SHIP 載體可以顯著阻止這一過程；在DM 小鼠體內腹腔注射SHIP 表達載體促使SHIP 高表達后發現，Akt 與結締組織生長因子（CTGF）的表達明顯降低，腎小管細胞的ECM 積累減少。可見，過表達SHIP 可能是一種通過失活PI3K/Akt 通路和抑制DKD 中CTGF 的產生來減少ECM 積聚的有效方法[62-64]。

5 總結

自噬廣泛存在于足細胞內，感知細胞內外能量變化并激活相應通路作出應答。生理情況下，PI3K/AKT/mTOR 通路往往不被激活；在DKD 初期，細胞處于饑餓環境下并具有一定的代償能力，以PI3K/AKT/mTOR 通路為軸，HGF、EGF、GSK3β-TFEB 等多種調節因子共同參與自噬，線粒體的生化反應以及細胞的大分子營養物質的生物合成得以順利進行。然而，在DKD 終末期，MS 是其常見的并發癥，TXNIP、SPAG5-AS1 等相關因子產生增多，SHIP 含量降低，抑制自噬，加速足細胞凋亡。上述多項研究結果多基于體外試驗，為推進靶向治療的進一步發展，今后還應加大藥物研發力度，提高藥物療效。