藻菌共生體對養豬廢水中抗生素和常規污染物的去除效果研究

徐長江，趙永軍，劉 娟*，劉 麗

（1.浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014；2.嘉興學院 生物與化學工程學院，浙江 嘉興 314001)

抗生素被廣泛用于預防和治療人類感染傳染病和獸醫治療，是一種具有抗細菌和抗真菌作用的活性物質，尤其在畜牧業能夠促進牲畜生長和預防傳染性疾病[1]。然而，抗生素在人體和動物體內的吸收率往往不足50%[2]。大部分抗生素直接經人或動物的消化系統，以原形或代謝產物形式隨尿液和糞便排到環境中。國內外的調查研究表明，在地表水、土壤及沉積物等環境介質中廣泛地檢測到各類抗生素的存在。據報道，養豬廢水中抗生素含量較高，土霉素濃度為0.73～354.0 mg/kg，金霉素濃度為0.68～139.4 mg/kg，磺胺嘧啶濃度為0.68～98.8 mg/kg[3]。如果養豬廢水未經任何處理直接排入環境中，廢水中殘留的抗生素將會對環境和人類健康產生巨大的潛在危害，環境中的抗生素會沿食物鏈進入人體，使人體產生耐藥性，危害人體生命健康[3]；會改變土壤中細菌的抗藥性[4]；對水生動植物產生毒效應[5]等。由于抗生素具有較高的水溶性和較低的生物可降解性，故很難將其從環境中去除。因此，加強抗生素去除相關的基礎與應用研究，開發去除抗生素的高效、綠色技術已迫在眉睫。

微藻是一類單細胞光合生物的總稱，包括藍藻及真核藻類，具有生長速率快、對環境無污染等特點。利用微藻進行廢水處理，既能高效去除抗生素、氮磷等營養物質，又能降低能耗。目前，關于微藻去除廢水中抗生素的有效性已被證實，相對于傳統的化學、物理去除方法，該生物技術具有處理效率高、成本低、不需要任何吸附劑或者催化劑，且可以有效同步去除水體中的營養物TP、TN 等優點[6]。當微藻接觸抗生素時，藻細胞為了生存會通過一系列反應清除有毒抗生素。在此期間，藻細胞可通過吸附、積累、生物降解等途徑去除廢水中的抗生素[7]。周楠等[8]研究發現，微藻對頭孢拉定的去除率達到70%。Gojkovic 等[9]用一種耐熱性小球藻（Chlorella sorokiniana）對氧氟沙星12 d 的去除率達到65%，普通小球藻（Chlorella vulgaris）對土霉素12 d 的去除率為69%。最近研究發現，菌類微生物能夠強化微藻對廢水中抗生素和常規污染物的去除效果。Liu 等[10]構建的微藻-細菌顆粒淤泥系統對四環素和磺胺嘧啶的去除率分別高達79.0%和94.0%。Bodin 等[11]證實了真菌也可以強化微藻對抗生素的去除效果，小球藻-黑曲霉菌共生體對廢水中雷尼替丁具有顯著的去除效果，去除率為(50±19)%，而真菌對雷尼替丁的去除率僅為(20±13)%。本研究通過構建小球藻-靈芝菌共生體，研究其對模擬養豬廢水中鹽酸土霉素（OTC）、鹽酸環丙沙星（CPFX）、磺胺二甲嘧啶（SM2）三類抗生素和營養物質TP、TN 的去除效果。同時，分析藻菌共生體的生長性能和光合性能，為藻技術在廢水處理領域的有效應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HZ-9310KBG 恒溫搖床培養箱，湖南邁達儀器有限公司；SW-CJ-2D 型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；YXQ-LS-75Sll 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；UV-6000PC 紫外可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司；AP-C100 掌上水體葉綠素熒光儀，北京易科泰生態技術有限公司；1260 型高效液相色譜儀，美國Agilent 公司。

實驗所用的小球藻藻種購于中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫，編號為FACHB-8。靈芝菌菌種購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為5.765。BG11 培養基、PDW 培養基均購于海博生物技術有限公司。葡萄糖、尿素、NaHPO4·2H2O、KH2PO4、CaCl2、MgSO4均 為 分 析純，購于國藥集團。鹽酸土霉素（OTC）（CAS 號：2058-46-0）、鹽酸環丙沙星（CPFX）（CAS 號：93107-08-5）、磺胺二甲嘧啶（SM2)（CAS 號：57-68-1）、濃硫酸、丙酮、Ag2SO4等均為分析純。

1.2 藻菌共生體的構建

小球藻在BG11 培養基擴大培養至藻密度為107 個/mL，培養條件：25 ℃，光照強度為200 μmol·m-2·s-1，保持12 h 光照/12 h 黑暗的光周期。靈芝菌在PDW 培養基中搖成約0.5～1 cm 直徑的真菌球，培養條件：溫度為(28±0.5)℃，轉速為160 r/min，黑暗條件。

藻菌共生體干重接種比為藻：菌＝10：1，在超凈工作臺取小球藻泥和靈芝菌菌球加入模擬養豬廢水（由葡萄糖、尿素、NaHPO4·2H2O、KH2PO4、CaCl2、MgSO4配置而成，COD：1424 mg/L，TN：348 mg/L，TP：42 mg/L）中，置于恒溫搖床培養箱中25 ℃黑暗處理12 h，轉速為160 r/min，使小球藻完全吸附到靈芝菌菌球上。

1.3 養豬廢水凈化

分別以藻菌共生體、小球藻、靈芝菌處理模擬養豬廢水，實驗組及空白組均設置三組平行。實驗步驟：在超凈工作臺操作，向配置好的200 mL模擬養豬廢水中加入鹽酸土霉素，緊接著投入50個藻菌共生體。同時，向200 mL 模擬養豬廢水中分別加入與藻菌共生體同等干重的小球藻和靈芝菌菌球。將藻菌共生體凈化體系、小球藻單一培養凈化體系和靈芝菌菌球單一培養凈化體系分別置于恒溫搖床培養箱中，在25 ℃下進行實驗，保持12 h 光照/12 h 黑暗的光周期，轉速為160 r/min。空白組不加入任何生物材料，僅為含鹽酸土霉素的模擬養豬廢水。鹽酸環丙沙星與磺胺二甲基嘧啶凈化操作同上。其中，3 種抗生素的初始濃度均為60 mg/L，COD 含量為第1 天、第3天、第5 天取樣檢測，其余指標均為每天檢測。

1.4 分析方法

1.4.1 葉綠素a（CHL-a）濃度測定

取4 mL 藻液或者一個藻菌共生體，離心（8000 r/min）處理10 min，棄去上清液，向沉淀中加入90%體積分數的丙酮，使用旋渦混合器混勻，使沉淀完全溶于丙酮，放置于4 ℃下黑暗環境處理24 h。24 h 后將樣品離心（8000 r/min）處理10 min，取上清液用紫外可見光分光光度計分別測量630 nm、645 nm、663 nm 和750 nm 處波長的吸光度，用90%丙酮做空白對照。葉綠素a（Chl-a）濃度計算見式（1）。

式（1）中：ρ(Chl-a)為葉綠素a 濃度，mg·L-1；A663、A750、A645、A630 分別為對應波長下測得的樣品吸光度數值。

1.4.2 碳酸酐酶活性測定

采用Wilbur-Anderson 電量法測定。取4 mL小球藻液離心10 min，轉速為4000 r/min，將離心收集的沉淀用去離子水洗滌3 次，然后懸浮在4 mL預冷的1 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）和1 mmol/L EDTA 的0.010 mol/L Tris 緩沖液（pH 為8.3）中洗滌2 次。再次離心10 min，轉速為4000 r/min，將離心收集的沉淀懸浮在4 mL 預冷的上述Tris 緩沖液（pH 為8.3）中，再迅速加入4 mL 冰浴CO2飽和蒸餾水后，記錄pH 從8.3 下降到7.3 所需的時間。為保持實驗過程的溫度控制在4 ℃，整個過程在冰浴中進行。碳酸酐酶活性的計算公式見式（2）。

式（2）中：UA 為每個細胞的活性單位（units of activity），表示酶活性；T（black）為反應體系中未加藻細胞的空白對照pH 下降所需的時間；T（test）為反應體系中加藻細胞時pH 下降所需的時間。

1.4.3 小球藻光合性能測定

使用AquaPen 手持式葉綠素熒光測量儀進行測量。測量前取4 mL 小球藻進行暗適應10 min，然后將其倒入測量儀配備的比色皿中，再放入葉綠素熒光測量儀，測量快速葉綠素熒光動力學（OJIP）參數。

1.4.4 總氮、總磷和化學需氧量測定

按照HJ 636—2012 的方法，用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定模擬養豬廢水中的總氮（TN）；按照GB 11893—89 的方法，用鉬酸銨分光光度法測定模擬養豬廢水中的總磷（TP）；按照GB 11914—89 的方法，用重鉻酸鉀法測定模擬養豬廢水中的化學需氧量（COD）。

1.4.5 抗生素含量測定

取4 mL 樣品離心（8000 r/min）處理10 min，將上清液過0.45 μm PES 濾膜，濾液用于抗生素含量測試。

其中，鹽酸土霉素采用高效液相色譜法測定，液相條件為：色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；洗脫流動相：乙腈與0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉的體積比為20%:80%；流速為1 mL·min-1；柱溫為35 ℃；檢測波長為355 nm；進樣量為20 μL。

鹽酸環丙沙星與磺胺二甲嘧啶采用分光光度法測定，分別于波長277 nm 與260 nm 處以純水做參比測定吸光度。其中，鹽酸土霉素標準曲線：y=0.0336x+1.4813，R2=0.9999；鹽酸環丙沙星標準曲線：y=13.979x+0.5682，R2=1；磺胺二甲嘧啶標準曲線：y=16.811x+0.4622，R2=1。

2 結果與討論

2.1 藻菌共生體對抗生素的去除效果

3 種抗生素的初始濃度均為60 mg/L，小球藻、靈芝菌和藻菌共生體對3 種抗生素的去除效果見圖1。由圖1（a）可知，藻菌共生體對OTC 的去除效果較好，第5 天去除率高達(89.93±1.70)%；其次是小球藻，去除率為(60.41±2.21)%；靈芝菌去除率為(50.06±2.75)%。由圖1（b）和（c）可知，小球藻、靈芝菌和藻菌共生體對SM2 和CPFX 無明顯的去除效果。

圖1 抗生素去除效果Fig.1 Removal effect of antibiotic

由圖1（a）可知，在第1 天到第2 天、第3 天到第5 天，藻菌共生體對OTC 去除率的斜率與小球藻和靈芝菌單獨對OTC 去除率的斜率基本一致，可知藻菌共生體剛開始在OTC 的脅迫下不能進行良好的相互作用和物質交換，因此初始階段去除率不高。結合CHL-a、CA 活性和OJIP 光合性能參數可知，在第3 天藻菌共生體對OTC 的去除率突然增長可能是發生了生物降解。隨著OTC濃度的降低，去除率也隨之降低，推測有兩種可能：一是OTC 的脅迫作用降低后，對藻菌共生系統的危害性降低，故后者也并不急需將OTC 進行生物降解；二是OTC 的濃度降低后，抗生素與藻菌共生系統的比例也隨之改變，而這個比例影響抗生素降解。除了生物降解還有另一種可能機制，Zhang 等[12]發現諾氟沙星的降解率與小球藻和Fe（Ⅲ）有關，分別測定了諾氟沙星在小球藻、Fe（Ⅲ）和小球藻加Fe（Ⅲ）中的光解情況，實驗結果與本實驗藻菌共生系統對OTC 的降解情況基本一致，諾氟沙星在含有藻類的溶液中通過藻類產生的羥基自由基氧化而快速降解，這一過程在Fe（Ⅲ）的協同下會加快，OTC 的單獨降解機理基本為光解，普通小球藻和靈芝菌可能產生促光解的基團或者自由基，而藻菌共生系統有可能產生促進光解過程的更強基團或自由基。

2.2 藻菌共生體對常規污染物的去除效果

圖2 為含OTC 的模擬養豬廢水中COD、TN和TP 的去除率，在第5 天藻菌共生體對TP、TN、COD 的去除效率分別是(76.42±1.51)%、(74.41±1.68)%、(46.05±9.30)%。通常來說，微藻單獨去除營養物的能力不如藻菌共生體，形成共生體后，真菌通過消耗有機物產生CO2供微藻用于光合作用。同時，微藻又釋放氧氣促進真菌生長，并且某些真菌胞外酶可以將大分子污染物轉化為小分子化合物，能夠提高微藻對營養物的去除率[13]。如圖2 所示，第1 天的TP、TN 去除率，藻菌共生體要高于單獨的微藻與靈芝菌，隨后去除率幾乎相同，推測是在高濃度的抗生素脅迫下，藻菌共生體吸收營養物的效率遭到了抑制。最終藻菌共生體對于污染物的去除無明顯優勢，可以看到，靈芝菌和藻菌共生體對TP 的去除前期與小球藻相比有優勢，但第4 天開始出現反彈。三者對TN的去除率不相上下，對COD 的去除靈芝菌較有優勢。

圖2 藻菌共生體對模擬養豬廢水中TP、TN、COD的去除效率Fig.2 Removal efficiency of TP,TN and COD from simulated pig wastewater by microlgal-fungal symbiosis

2.3 藻菌共生體生長性能分析

2.3.1 Chl-a 含量

葉綠素a（Chl-a）是微藻內的一種色素，用于吸收光進行光合作用，其含量可以作為判斷微藻生長情況的重要指標[14]。圖3 分別是藻菌共生體和小球藻中小球藻在不同抗生素作用下的Chl-a含量變化。對小球藻而言，最初兩天3 種抗生素均能促進小球藻生長，這符合抗生素作用與藻類的普遍規律，由于藻類伴生雜菌的存在，一定濃度范圍內的抗生素在第1 天均會不同程度地促進微藻的生長。姜思等[15]選用4 種抗生素作用于萊茵衣藻上，發現不同濃度的四環素在前兩天對微藻均有不同程度的促進作用，并呈現抗生素劑量依賴效應。CPFX 與OTC 組分別在第3 天和第4 天對小球藻產生了明顯的抑制作用，聶湘平等[16]研究出鹽酸環丙沙星對蛋白核小球藻的毒性屬于中等。崔探[17]指出鹽酸環丙沙星對三角褐指藻的細胞形態、抗氧化性、膜透性及光合作用均產生毒性影響。對于OTC 影響的小球藻，在第4天Chl-a 猛然增長，隨后在第5 天達到峰值后又幾乎同趨勢減少，說明從第5 天開始藻的光合作用抑制率達到最大，藻細胞無法獲得充足的能量，生長受到抑制，甚至導致葉綠體結構破裂，從組織內流出[18]。而SM2 幾乎對小球藻沒有明顯影響。由此可知，3 種抗生素中，CPFX 對普通小球藻毒性最大。對藻菌共生體而言，CPFX 與OTC 一開始就對藻菌共生體上的微藻有微弱的抑制作用；SM2 則對藻菌共生體有明顯的促進作用，這可能是磺胺類抗生素對雜菌的特異性抑菌機理造成的。徐明等[19]利用平菇菌和普通小球藻構建藻菌共生體，小球藻的生物量顯著增加。

圖3 不同抗生素對藻菌共生體和小球藻Chl-a含量的影響Fig.3 Changes of Chl-a content in microalgalfungal symbiosis and Chlorella vulgaris with different antibiotics

2.3.2 碳酸酐酶活性

碳酸酐酶（carbonic anhydrase,CA）是一種含鋅金屬酶，是微藻中固定CO2的關鍵酶，其作用是催化CO2轉化為碳酸氫鹽[20]。由圖4 可知，OTC和CPFX 對普通小球藻CA 活性有抑制作用，其中CPFX 尤為明顯，從第4 天開始CA 活性明顯下降，SM2 則對CA 活性無明顯影響。正如Chen等[21]發現喹諾酮類、四環素類、氨基糖苷類、β-內酰胺類對藍藻胞外碳酸酐酶均有不同程度的抑制作用一樣，這可能與喹諾酮類和四環素類對藻類的抑制作用有關。在藻菌共生體上也是如此，由圖4 可知，OTC 和CPFX 對藻菌共生體的CA活性也有抑制作用。第4 天OTC 組CA 活性突然增加，結合OTC 第4 天的降解率突然增加，CA 的活性與OTC 的降解效率高度相關，有可能是胞外碳酸酐酶的活性提高促進了CO2的固定，加速了光能向化學能的轉換，促進了OTC 進入藻細胞進行生物降解。SM2 小球藻的CA 活性有促進作用，這與CHL-a 的結果高度一致，推測是磺胺類抗生素對雜菌的特異性抑制作用。實驗結果與小球藻的CHL-a 含量結果基本一致。

圖4 不同抗生素對藻菌共生體和小球藻CA 活性的影響Fig.4 Effects of different antibiotics on CA activity of microalgal-fungal symbiosis and Chlorella vulgaris

2.4 藻菌共生體光合性能分析

不同抗生素廢水中藻菌共生體和小球藻第4天的葉綠素熒光數據見表1。對暴露在抗生素下的小球藻，3 種抗生素的FV/FM和PIABS均處在正常區間，其中OTC 中小球藻的最大光學效率最高，性能指數最明顯，光合性能最好。對于藻菌共生體，OTC 和SM2 的Fv/FM和PIABS遠高于CPFX，ΨO、ΦEO和ΦDO的變化透露出微藻對光能的吸收和電子傳遞效率下降，最大電子傳遞產量降低，幾乎無法進行PSⅡ。結果均表明CPFX 對小球藻的脅迫作用最大，這與CHL-a 和CA 活性結果基本一致。

表1 不同抗生素第4 天藻菌共生體和小球藻葉綠素熒光數據

圖5 為OTC 組藻菌共生體上小球藻OJIP 各個參數的變化情況，前兩天的數據表示，微藻在OTC 的脅迫下，光能的吸收性能指數（PIABS）降低，捕獲的機子能導致電子傳遞的效率（ΨO）降低，電子傳遞的量子產額（ΦEO）降低，進而導致微藻的最大光學效率（Fv/FM）在逐漸降低，預示著有活性的反應中心數目下降，所以微藻便迫使剩余的有活性反應中心的效率提高，從而導致吸收的光能增加（ABS/RC），熱耗散（ΦDO）增加。然后便開始轉變，首先是第2 天光系統捕獲機子導致電子傳遞的效率（ΨO）開始增加，緊接著其他參數均在第3天出現拐點，結合此時OTC 的降解率猛然增加，脅迫微藻的抗生素濃度在一天時間內減少了至少40%，微藻的最大光學效率和性能指數開始上升，且后者上升更加明顯，這表明PIABS能夠更加靈敏地反映光學反應的變化[23]，隨后各個參數的反彈，均表明在OTC 濃度降低后微藻的光合作用得到緩解，這也進一步證明OTC 被逐漸降解成對微藻沒有脅迫作用的產物，揭示了OTC 的降解途徑為生物降解而非生物吸附和生物積累。

圖5 OTC 作用下藻菌共生體的OJIP 各個參數變化情況Fig.5 Changes of OJIP parameters of microalgal-fungal symbiosis under the action of OTC

3 結論

小球藻-靈芝菌共生體對OTC 有明顯的去除能力，第5 天的去除效率高達(89.93±1.70)%，同樣條件下小球藻和靈芝菌對OTC 的去除效率分別為(60.41±2.21)%和(50.06±2.75)%，藻菌共生體對OTC的降解有明顯的優勢，但是三者對SM2 和CPFX均無去除效果。藻菌共生體對TP、TN、COD 的最終去除效率分別為(76.42±1.51)%、(74.41±1.68)%、(46.05±9.30)%。無論在哪種抗生素體系中，小球藻、靈芝菌和藻菌共生體對TP、TN、COD 的去除效果均大同小異。第4 天的小球藻Chl-a、CA 和藻菌共生體葉綠素熒光數據均表明：CPFX 無論是對小球藻還是藻菌共生體均有明顯的脅迫作用，說明高濃度CPFX 對小球藻毒性較大。雖然SM2 能促進藻菌共生體的生長，但和小球藻之間無明顯相互影響。本文構建的小球藻-靈芝菌共生體，對鹽酸土霉素具有很強的去除效率，對生物方法處理廢水中抗生素具有一定的理論指導意義和應用價值。在后期研究中，應關注如何將藻菌共生體系應用于環境污染抗生素處理并實際應用，同時進一步完善藻菌共生體處理抗生素的機理研究。