基于羧基化聚吡咯-氯化血紅素和點觸發鏈置換反應信號放大的電化學生物傳感器檢測轉基因作物中CaMV35S序列

翟應惠，夏子豪，張鴻雁，葉永康，2*，操小棟，鄭海松，李云飛*

（1．合肥工業大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009；2．北方民族大學 生物科學與工程學院，寧夏 銀川 750021；3．合肥海關技術中心，安徽 合肥 230022）

在過去20年，轉基因技術得到了極大的發展，轉基因作物的種植面積也逐年增加［1］，我國轉基因作物產業化駛入“快車道”，轉基因作物產業化布局已覆蓋全國。同時，為確保生物安全、生態安全及滿足人們對轉基因產品的關切，不僅需要制訂一系列轉基因作物∕產品的安全評價程序、方法和管理措施［2］，也對轉基因檢測技術提出了更高的要求［3］。

目前，針對轉基因成分的檢測主要有兩大類，即針對轉基因作物∕產品中特定蛋白質成分［3］和DNA特定序列進行檢測［4］。當前針對轉基因作物∕食品中常見的外源基因花椰菜病毒35S（CaMV35S）啟動子［4］和根癌農桿菌終止子（TNOS）［5］檢測的DNA生物傳感器已成為篩查轉基因作物的重要途經。其中，DNA電化學生物傳感器因具有快速、簡便和成本低廉等特點，成為轉基因作物∕產品檢測方法研究的熱點之一［6-7］。

納米聚合物聚吡咯（PPy）因具有良好的導電性、熱穩定性、納米模擬酶活性且易于合成等特性，在電化學傳感器中得到了較為廣泛的應用［8］。氯化血紅素（Hemin）是血紅蛋白家族的“活躍分子”，其性質穩定，催化活性與過氧化物酶類似［9-10］。因此，基于Hemin的模擬過氧化物酶活性而設計的電化學DNA傳感器亦越來越受到關注［11-12］。

點觸發鏈置換反應（TSDR）是通過核酸輔助擴增來改善生物傳感器性能的技術，具有靈敏度高、操作便捷和穩定性高的特點［13］。通過觸發反應的單鏈DNA觸發鏈置換反應，進而暴露出另一段可與其它模板互補的單鏈區域，并通過引入具有更多的堿基互補配對數的模板鏈，置換目標DNA，進一步引發新的點觸發鏈置換反應，從而起到信號放大的作用［13］。基于該技術開發的電化學生物傳感方法可用于靈敏檢測艾滋病毒（HIV）相關的DNA［14］及microRNA-21［15］。

本研究制備了Hemin復合的羧基化聚吡咯納米復合物（cPPy-hemin），并以其為標記物標記由信號DNA鏈（Ps）、模板鏈（Ts）和輔助鏈（As）結合所形成的DNA雙鏈體結構，利用cPPy-hemin對底物H2O2的模擬酶催化特性和TSDR信號放大作用，建立了一種靈敏檢測CaMV35S的電化學生物傳感器。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

吡咯（Py，純度＞ 99．7%），巰基乙醇（MCH，99%），三（2-羧乙基）膦（TCEP）氯，三（羥甲基）氨基甲烷（Tris，99%），氯化血紅素（Hemin，95%），聚乙烯醇（72．5% ～ 74．5%，4．2 ～ 5．0 mPa∕s）和氯金酸（三水合物，99%）購自上海阿拉丁生物科技股份有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，90%）及乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA，99%）購自國藥集團化學試劑有限公司；dNTP mixture、DNA聚合酶（Taq DNApolymerase）購自生工生物工程（上海）有限公司。實驗所用緩沖溶液為：DNA儲存緩沖溶液（10 mmol∕L Tris-HCl，1．0 mmol∕L EDTA，pH 7．4），DNA固定緩沖液（10 mmol∕L Tris-HCl，1．0 mmol∕L EDTA，1．0 mmol∕L TCEP，0．1 mol∕L NaCl，1．0 mmol∕L MgCl2），DNA雜交緩沖液（10 mmol∕L Tris-HCl，1．0 mmol∕L EDTA，0．1 mol∕L NaCl，1．0 mmol∕L MgCl2），電化學測試緩沖溶液（0．1 mol∕L磷酸鹽緩沖溶液，pH 8．0），CTAB緩沖液（0．1 mol∕L Tris-HCl，20 mmol∕L EDTA，1．4 mol∕L NaCl，2% CTAB）。實驗所用其它試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。實驗所用的DNA序列由生工生物工程（上海）有限公司合成并純化，序列如下：

捕獲探針（Cs）：SH-TTTT AGG AGC GAC TAA。

CaMV35S序列（tDNA）：ATT GTG CGT CAT CCC TTA CGT C。

模板鏈序列（Ts）：GAC GTAA GGG ATG ACG CAC AAT CAGGC AGG AGC GAC TAA。

輔助鏈序列（As）：TTTT TTTT TTTT TTTT A GCCTG ATT GTG CGT CAT CCC T。

信標鏈序列（Ps）：NH2-TTT TTT TTT TTT TTA GTC GCT CCT。

綜上所述，循證護理系列培訓能夠在臨床護理實踐工作中發揮重要作用，對護理人員的護理工作提高有促進作用，對促進我院護患關系的發展有著重要作用。

燃料鏈序列（Fs）：TTA GTC GCT CCT GCC TGA TTG TGC GTC ATC CCT。

單堿基錯配序列（Mis1）：ATT GTG CGT CAT CCC TTA CTT C。

非互補DNA序列（NOs）：GCA TGA CGT TAT TTA TGA GAG A。

非互補DNA序列（FMV）：A TCT TTG CAA TAA AGG CAA AGA。

正向引物：CTT CCT TTC TCG CCA CGT T。

反向引物：CTT AAT AAC ACA TTG CGG ACG TT。

1.2 儀器與方法

材料的形貌表征在SU8020場發射掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司）上進行。材料的成分及元素分析在ESCALAB250Xi（美國賽默飛世爾科技公司）和X射線光電子能譜儀（XPS）上進行。電化學表征及測試在配有三電極體系的CHI832D電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）上進行，以直徑為3 mm的修飾玻碳電極（GCE）為工作電極，Ag∕AgCl（飽和KCl）電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。采用電化學阻抗譜（EIS）表征修飾的GCE。EIS實驗在含5．0 mmol∕L ［Fe（CN）6］3-∕4-的0．1 mol∕L KCl溶液中進行，頻率范圍為1 ～ 10 000 kHz。采用計時電流法（i-t）測定不同濃度的目標CaMV35S基因，測定電位為-0．4 V，緩沖溶液為0．1 mol∕L pH 7．0的PBS，H2O2濃度為2 mmol∕L。

1.3 cPPy-hemin的制備

1.4 Ts/As/Ps-cPPy-hemin納米信標的制備

利用信標鏈序列Ps上的—NH2與cPPy-hemin中—COOH之間的共價鍵合反應，制備基于cPPyhemin的Ts∕As∕Ps DNA雙鏈結構納米信標。具體方法如下：將含Ts、As、Ps的核苷酸鏈混合溶液（濃度均為30 μmol∕L，各100 μL）加熱至95 ℃，保持2 min后自然冷卻至室溫，形成Ts∕As∕Ps三鏈DNA雙鏈體結構；將含有10 μmol∕L Ts∕As∕Ps DNA雙鏈體結構、10 mg∕mL EDC、5 mg∕mL NHS和2 mg∕mL cPPy-hemin的混合溶液在輕微振蕩下反應2 h，離心去除未結合的DNA，將所制備的Ts∕As∕Ps-cPPy-hemin分散于雜交緩沖液中。

1.5 DNA生物傳感器的制備

GCE依次用1．0、0．3、0．05 μm氧化鋁漿拋光，先后用硝酸（1∶1）、乙醇和水進行超聲清洗，并在室溫下氮氣吹干備用。DNA生物傳感器的構建步驟為：將預處理的GCE浸入5．0 mL含3．0 mmol∕L HAuCl4的KNO3（0．1 mol∕L）溶液中，在-0．2 V恒定電位下電化學沉積70 s以獲得電沉積AuNPs修飾的GCE（AuNPs∕GCE）。然后，將5 μL 1 μmol∕L的捕獲探針Cs滴加至AuNPs∕GCE，頂部罩上離心管密封，并在4 ℃冰箱中放置12 h后，用0．1% SDS溶液和10 mmol∕L Tris-HCl（pH 7．4）溶液沖洗電極以除去未結合的捕獲探針，所得修飾電極記為Cs∕AuNP∕GCE。接著，該修飾電極用5 μL MCH（1 mmol∕L）封閉30 min（頂部罩上離心管密封），以消除非特異性吸附。最后，用10 mmol∕L Tris-HCl（pH 7．4）溶液和水沖洗電極，得到MCH∕Cs∕AuNPs∕GCE。

1.6 電化學測量

將不同濃度的目標CaMV35S與10 μL Fs（10 μmol∕L）和10 μL上述制備的Ts∕As∕Ps-cPPy-hemin懸浮液混合，用雜交緩沖液稀釋至50 μL；將MCH∕Cs∕AuNPs∕GCE插入上述混合液中，在37 ℃條件下溫育90 min，充分淋洗后采用計時電流法進行電化學測量。

1.7 樣品的制備與檢測

轉基因大豆中的CaMV35S片段用CTAB法提取：將0．1 g轉基因大豆置于研缽中用液氮研磨后放入5 mL離心管中，加入600 μL CTAB裂解緩沖液，混勻后65 ℃水浴1 h，期間不斷晃動。待材料冷卻至室溫后在10 000 r∕min下離心10 min，上清液加入600 μL氯仿-異戊醇混合液（24∶1，體積比）進行抽提，清液中再加入400 μL異丙醇，-20 ℃條件下預冷后，10 000 r∕min離心10 min，吸取上清液，用75%乙醇清洗沉淀3次，室溫下晾干后加入40 μL TE溶解，加入RNase酶37 ℃溫育30 min后，所得溶液即為大豆DNA溶液。

PCR反應總體積為50 μL，包括25 μL PCR Mix，5 μL提取的DNA，1 μL正反向引物（10 μmol∕L），18 μL ddH2O。PCR擴增條件為：94 ℃ 5 min（DNA變形，雙鏈解開），采用以下三步進行30個循環：94 ℃45 s（DNA變性，雙鏈解開），64 ℃ 45 s（引物退火），72 ℃ 1 min（DNA鏈延伸），然后在72 ℃下延伸10 min。最后，將5 μL PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳實驗，通過凝膠成像鑒定PCR產物。

2 結果與討論

2.1 納米材料與傳感器組裝的表征

采用TEM表征cPPy-hemin的形貌，結果如圖1A所示。可以看出，cPPy-hemin納米顆粒呈球狀均勻分布，粒徑約為50 nm。對其進行XPS分析（圖1B）發現，譜圖中位于723．44、532．22、399．80、284．78 eV處的光電子峰，分別對應于Fe2p、O1s、N1s及C1s的結合能［18］。其中，材料中的Fe2p光電子峰來自復合物中Hemin的鐵活性中心。XPS的表征結果表明cPPy-hemin納米復合物已成功合成。

圖1 cPPy-hemin的TEM圖（A）及XPS表征（B）Fig．1 TEM image（A） and XPS characterization（B） of cPPy-hemin

電化學DNA生物傳感器的修飾過程通過EIS進行表征，其半圓直徑可用于表示電荷傳遞阻抗的大小。圖2分別為裸GCE、AuNPs∕GCE、Cs∕AuNPs∕GCE、MCH∕Cs∕AuNPs∕GCE和Ps-cPPy-heminMCH∕Cs∕AuNPs∕GCE在含0．1 mol∕L KCl的5 mmol∕L［Fe（CN）6］3-∕4-溶液中的EIS曲線。由圖可知，電沉積AuNPs后，AuNPs∕GCE（曲線b）的阻抗較裸GCE（曲線a）小，主要是由于AuNPs有較大的比表面積和優良的導電性，極大地改善了電極的電子傳輸性能；當Cs通過Au-S鍵組裝到AuNPs∕GCE后，Cs∕AuNPs∕GCE的阻抗（曲線c）較AuNPs∕GCE大幅增大，且當用MCH對Cs∕AuNPs∕GCE上未結合的活性位點進行封閉后，所組裝的MCH∕Cs∕AuNPs∕GCE的阻抗進一步增大（曲線d）。這主要是由于組裝在電極表面的Cs和MCH阻止了［Fe（CN）6］3-∕4-向電極表面擴散，降低了電子傳輸 速 率。最 后，當MCH∕Cs∕AuNPs∕GCE在 目 標CaMV35S（100 pmol∕L）和Ts∕As∕Ps-cPPy-hemin混合溶液中溫育90 min后，修飾電極的阻抗再次降低（曲線e），表明電子在該修飾電極上傳輸速率較快。這是由于此時電極表面形成了DNA雙鏈-cPPyhemin納米結構，即Cs-Ps-cPPy-hemin納米結構，該結構中的雙鏈DNA的電子傳遞速率比單鏈DNA高［19］，同時納米結構中的cPPy-hemin也可提高電子傳遞速率。

圖2 不同修飾電極的電化學阻抗譜Fig．2 Electrochemical impedance curves of different modified GCEs

2.2 CaMV35S基因傳感器的原理及可行性分析

CaMV35S基因傳感器對目標的靈敏檢測主要基于cPPy-hemin對H2O2的模擬過氧化物酶活性及TSDR目標放大策略。該傳感器對目標CaMV35S的檢測是通過傳感界面結合Ps-cPPy-hemin后，所形成的納米結構中cPPy-hemin對H2O2的催化還原產生的電信號實現，其電信號大小和電極表面所結合的cPPy-hemin的量有關。如圖3A所示，當目標CaMV35S觸發TSDR后，所釋放的信標Ps-cPPyhemin隨著CaMV35S濃度的增加，通過Cs-Ps雜交結合在電極表面的cPPy-hemin亦越多（圖3B），因而其催化H2O2還原的電信號越大。圖4A為傳感器在不同條件下對檢測體系中H2O2的計時電流法安培響應曲線。當不存在Fs（圖4A曲線a）或目標DNA（圖4A曲線b）時，TSDR過程無法進行，因而無法釋放出信號標簽Ps-cPPy-hemin，導致H2O2在電極表面的還原信號低。然而，當使用100 pmol∕L CaMV35S觸發TSDR后，釋放的Ps-cPPy-hemin與電極表面的Cs通過雜交反應相結合，導致H2O2的催化還原電流信號提高（圖4A曲線d）。同時，通過比較采用TSDR策略及夾心策略（圖4A曲線c）所記錄的H2O2催化還原電流信號的大小，評估了TSDR過程對傳感系統信號的放大作用。從圖中可明顯看出，在100 pmol∕L CaMV35S存在下，TSDR過程極大地放大了傳感界面上H2O2的電催化還原信號，起到了很好的信號放大作用。

圖3 電化學生物傳感器的組裝過程與策略Fig．3 Stepwise process of the fabrication and strategy of the proposed electrochemical biosensor

圖4 CaMV35S基因傳感器的原理及可行性驗證Fig．4 The principle and the feasibility of the fabricated CaMV35S genosensor

TSDR的過程也通過凝膠電泳圖像進行驗證，結果如圖4B所示。圖中泳道1、2、3分別為Ts、As和Ps三條單鏈的電泳圖，泳道4為由Ts、As和Ps三條單鏈雜交形成的Ts∕As∕Ps雙鏈結構。由圖可看出，該雙鏈結構的遷移速率明顯低于其它單鏈，表明Ts、As和Ps鏈雜交形成了DNA雙鏈體。圖中泳道5和6分別為目標CaMV35S序列和Fs的電泳條帶，當在Ts∕As∕Ps雙鏈結構加入目標CaMV35S和Fs充分混合90 min后，其電泳條帶（泳道7）中出現兩條明顯的條帶，其中一條對應于Ts∕As∕Ps雙鏈結構，而另一條新獲的亮帶則對應于Ts∕Fs雙鏈DNA條帶。這表明，目標CaMV35S的存在觸發了TSDR過程，導致模板鏈Ts與燃料鏈Fs結合形成了雙鏈。該結果表明在目標CaMV35S存在下可成功進行TSDR過程。

2.3 CaMV35S基因傳感器的分析性能

為使CaMV35S電化學傳感器具有最優的分析性能，分別對Ts∕As∕Ps雙鏈結構的濃度、檢測緩沖液的pH值、TSDR反應時間及雜交溫度等影響因素進行優化，結果如圖5A ～ D所示。由圖可知，CaMV35S傳感器的最優檢測條件為：Ts∕As∕Ps雙鏈結構的濃度為10 μmol∕L，緩沖溶液pH值為7．0，TSDR反應時間及雜交溫度分別為90 min和37 ℃。

圖5 CaMV35S基因傳感器檢測實驗條件的優化Fig．5 Optimization of experimental parameters

在上述最優實驗條件下，采用制備的傳感器對不同濃度的CaMV35S序列進行檢測。如圖6A所示，傳感器上H2O2的還原電流隨著目標物濃度的增大而增大，且電流變化值與CaMV35S濃度（1．0 × 10-14～1．0 × 10-9mol∕L）的對數呈線性關系（圖6B），回歸方程為ΔI（μA） = 0．042 4 + 0．686 lgc（mol∕L），相關系數（r2）為0．998。傳感器對目標CaMV35S的檢出限（S∕N= 3）為3．2 × 10-15mol∕L。表1列出了該傳感器與其它CaMV35S傳感器的性能數據。本文制備的傳感器表現出較寬的線性范圍和較低的檢出限，這可歸因于cPPy-hemin的優良模擬酶活性及TSDR的信號放大作用。

表1 不同CaMV35S生物傳感器性能的比較Table 1 Comparison of analytical performance of CaMV35S biosensors

圖6 CaMV35S基因傳感器對不同濃度CaMV35S的檢測Fig．6 Detection of CaMV35S using the fabricated genosensor

2.4 CaMV35S傳感器的選擇性、重現性與穩定性

通過比較CaMV35S傳感器對其它DNA序列（FMV基因序列、NOs基因序列和單堿基錯配Mis1）與對目標CaMV35S的電化學響應電流的大小，對其選擇性進行評估，結果如圖7A所示。由圖可知，傳感器對目標CaMV35S（100 pmol∕L）的響應電流明顯高于對其它序列（分別為1 nmol∕L）的響應電流。此外，傳感器對濃度分別為1 nmol∕L的其它DNA序列與100 pmol∕L CaMV35S混合液進行檢測后，所得的響應信號為100 pmol∕L CaMV35S的110%。上述結果表明該傳感器具有良好的選擇性。

采用相同方法分別制備6個傳感器，并將其用于檢測100 pmol∕L目標CaMV35S，測得其相對標準偏差（RSD）為2．4%（圖7B）。將傳感器放置冰箱4 ℃保存3、7、14 d后，在相同條件下測定，發現傳感器對100 pmol∕L目標CaMV35S的響應信號分別為最初信號（0 d）的96．9%、91．8%和88．2%（圖7C）。以上結果表明傳感器具有較好的重現性與穩定性。

圖7 傳感器的選擇性（A）、重現性（B）及穩定性（C）Fig．7 Selectivity（A），reproducibility（B） and stability（C） of the fabricated biosensor

2.5 實際樣品中CaMV35S序列的檢測

為評估該CaMV35S基因傳感器實際應用的可行性，采用計時電流法對轉基因大豆中的CaMV35S基因片段進行檢測。對轉基因大豆中總DNA進行提取后，以其為模板，PCR擴增后得到轉基因大豆中CaMV35S基因片段的PCR產物，其PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳如圖8A所示。由該圖可看出，當以轉基因大豆DNA提取物為模板，但未使用引物（泳道2）及非轉基因DNA提取物為模板（泳道3）時，電泳圖像中并未觀察到明顯的條帶。而以轉基因組DNA為模板，且在引物存在條件下（泳道4），圖中可觀察到250 ～ 500 bp處存在明顯的條帶（442 bp）。電泳結果表明，以轉基因大豆中的DNA提取物為模板成功擴增了CaMV35S基因片段長度為442 bp的PCR產物。隨后，以制備的CaMV35S基因傳感器對非轉基因大豆DNA提取物、轉基因大豆DNA提取物（有∕無引物條件）的PCR擴增產物進行檢測，結果如圖8B所示。由插圖可明顯看出，傳感器對非轉基因大豆的PCR產物無明顯的響應信號，而對轉基因大豆DNA提取物（有∕無引物）的PCR擴增產物均有響應，且對有引物存在條件下的PCR產物響應信號最強，計算得到該PCR產物的濃度為2．83 × 10-10mol∕L。結果證明，該傳感器能區分轉基因和非轉基因作物，可用于實際樣品中CaMV35S的檢測。

圖8 傳感器對轉基因大豆中CaMV35S基因片段的檢測Fig．8 Detection of CaMV35S in genetically modified soybean

3 結 論

本研究利用具有優良過氧化物模擬酶活性的cPPy-hemin作為納米信標，結合TSDR循環擴增的信號放大策略，建立了一種靈敏檢測特定轉基因序列的電化學生物傳感方法。在優化條件下，通過記錄該基因傳感器上cPPy-hemin對H2O2的催化所產生的電流信號變化，成功實現了對目標CaMV35S序列的靈敏檢測。該傳感器具有良好的選擇性、重現性和穩定性，可直接區分未經PCR擴增的非轉基因和轉基因大豆。