中獸藥口服液中非法添加化學藥物高分辨質譜篩查

霍寧寧，李研東，韓 雪，艾連峰，王振來

（1．河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2．河北省獸藥飼料工作總站，河北 石家莊 050035；3．石家莊海關技術中心，河北 石家莊 050011）

農業農村部2019年7月發布的194號公告［1］中規定，除中藥、驅蟲藥等部分藥物外，養殖環節禁止使用所有促生長和治療預防性藥物。自此藥物飼料添加劑退出歷史舞臺。而中獸藥因其天然、毒副作用小、價格低廉、符合法規要求等優勢［2］，在獸藥市場的激烈競爭中脫穎而出。中獸藥產品的快速崛起，在帶來利潤的同時也給不法分子帶來了可乘之機，有些企業利用中獸藥檢測技術滯后單一、標準匱乏的現狀，通過添加化學藥物的手段達到非法獲利的目的［3］。中藥植物源性成分來源多樣，有效成分復雜，如生物堿類、黃酮類、皂苷類、色素、糖類、揮發油等物質均可對常規儀器檢測產生影響［4-5］，因而快速篩查其中的非法添加物十分困難，且非法添加藥物的廣泛性和隱蔽性也對檢測儀器的選擇性、分辨率和準確性提出更高要求，傳統獸藥檢測方法和儀器顯然無法滿足高通量和快速的檢測要求。目前報道的關于獸藥中違禁藥物添加方面的儀器檢測技術主要有分光光度法［6］、氣相色譜法［7］、液相色譜法［8-9］、質譜法［2，10-11］等。其中《中華人民共和國獸藥典》［12］和農業農村部公告［13］等規定的獸藥檢驗方法多以液相色譜法為主，其前處理過程往往依據現有藥典和標準規范，方法適用性較差，抗干擾能力不足，檢測的目標物有限，對于獸藥中違禁藥物的檢測局限性較大。辜慧等［3］建立了UPLCMS∕MS法同時檢測減肥類、壯陽類、降糖類、解熱鎮痛類中藥制劑中易被添加的27種化藥成分，但檢測種類少，且此種類的中藥制劑成分較為簡單；曹秀等［10］建立了26種獸藥制劑中喹諾酮類、磺胺類、孔雀石綠及金剛烷胺的檢測方法，檢出限低，但檢測藥物種類少，在篩查中可能會忽略其他非法添加藥物；林仙軍等［14］采用UPLC-Q-TOF MS法建立了快速篩查獸藥中72種非法添加化學藥物的方法，但藥物的添加濃度較高。目前關于獸藥中非法添加化合物的分析標準只有四川省的DB 51∕T 1855-2014［15］和山東省的DB 37∕T 2817-2016［16］，而相關的國家和行業標準均未見報道。

隨著高分辨質譜的應用日益廣泛，其高選擇性、高靈敏度、高分辨率，以及對未知化合物的高通量篩查優勢愈加凸顯。結合高速發展的樣品前處理技術和復雜樣品基質成分的多組分分析技術被更多的研究者采用［14，17-24］，本文采用0．5%甲酸乙腈-水對樣品進行提取，將提取液經Oasis PRiME HLB固相萃取小柱凈化后，超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質譜進行檢測分析，建立了小分子篩查數據庫，結合Trace Finder篩查軟件分析，初步確立了適用于中獸藥口服液中167種非法添加藥物的高通量快速篩查方法。該方法可進行上百種非法添加藥物的篩查檢測，適用于復雜中藥基質的高選擇性、高通量的篩查，一定程度上擴充了藥物篩查種類和數量，適用于具備儀器條件的政府監管部門和第三方檢測機構使用，也可為相關企業在原材料質量風險控制、成品監督等方面提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

167種獸藥標準品（First Standard，阿爾塔公司）；乙腈（色譜純，默克公司）；屈臣氏蒸餾水；甲酸（88%，賽默飛世爾科技公司）。

UltiMate 3000-Q-Exactive Focus超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜，Accucore RP-MS色譜柱（Thermo公司）；Oasis PRiME HLB（6 mL，200 mg）固相萃取柱、HLB（3 mL，60 mg）固相萃取柱、MCX（6 mL，150 mg）固相萃取柱（Waters公司）；Captiva EMR-Lipid（3 mL，300 mg）固相萃取柱（Agilent公司）。

1.2 標準溶液配制

167種質量濃度為100 μg∕mL的標準品混標溶液，配制成10 μg∕mL的混標標準儲備液；準確量取167種混標儲備液（10 μg∕mL），用甲醇稀釋成1 μg∕mL的混合標準工作液待用。

1.3 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱：Accucore RP-MS柱（100 mm × 2．1 mm，粒徑2．6 μm）；流動相A：0．05%甲酸水；流動相B：0．05%甲酸乙腈；梯度洗脫程序：0 ～ 2．5 min，98% ～ 95% A；2．5 ～ 5．8 min，95% ～90% A；5．8 ～ 6．5 min，90% ～ 85% A；6．5 ～ 7．5 min，85% ～ 80% A；7．5 ～ 9．5 min，80% ～ 70% A；9．5 ～10．5 min，70% ～ 60% A；10．5 ～ 12 min，60% ～ 55% A；12 ～ 14 min，55% ～ 45% A；14 ～ 18 min，45% ～5% A；18 ～ 21 min，5% A；21 ～ 22．5 min，5% ～ 98% A；22．5 ～ 25 min，98% A；流速：0．3 mL∕min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI源），正負離子檢測模式（ESI+、ESI-）同時掃描，掃描方式為一級全掃描，數據依賴型二級質譜掃描（Full MS∕dd-MS2），源區主要參數設置：鞘氣流速：9 arb，噴霧電壓：3 kV，毛細管（離子傳輸管）溫度：320 ℃，S-lens電壓：55 kV，輔助氣加熱溫度：30 ℃。質譜一級掃描模式為Full MS，掃描范圍（m∕z）為100 ～ 900，一級分辨率為70 000，C-Trap的離子數目為1 × 106，離子最大注入時間為100 ms；二級掃描模式為dd-MS2模式，二級分辨率為35 000，頂點激發時間為3 ～ 6 s，設置階梯碰撞能分別為20、35、50 kV，動態排除時間為8 s。采集數據前使用正負離子校正液進行質量軸校正。質譜采集數據通過Xcalibur質譜工作臺提取化合物碎片離子信息，通過Trace Finder篩查軟件建立篩查數據庫。

1.4 樣品前處理

為構建適用于絕大部分樣品的前處理方法，實驗選擇樣品基質成分復雜，且不容易去除基質影響的清解合劑做為代表性樣品。

提取：稱取中獸藥口服液樣品0．25 g（精確至0．01 g），置于50 mL離心管中，準確加入20 mL 0．5%甲酸乙腈水（乙腈∶水 = 9∶1）溶液，渦旋混勻10 min，超聲提取20 min，12 000 r∕min 離心10 min；取上清液至25 mL容量瓶中定容，待凈化。

凈化：取上清液5 mL，過Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，將流出液在40 ℃下氮吹濃縮至0．1 mL左右，用0．2%甲酸水定容至1 mL，渦旋混勻做為原液。取原液0．2 mL定容到1 mL，渦旋混勻后做上機液，上機液過0．2 μm微孔濾膜后，供質譜分析。

1.5 篩查結果判定

參考《獸藥殘留檢測中質譜方法確證指南》［25］和歐盟2002∕657∕EC［26］準則，應用高分辨質譜對目標化合物進行分析時，若有1個母離子和1個子離子或2個子離子匹配則可確證分析的樣品含有該化合物。對于疑似陽性樣品，進一步在dd-MS2模式下針對疑似含有的化合物進行二級特征碎片離子掃描，當有2個或以上豐度較高的碎片離子與標準譜圖中相應的碎片離子精確質量偏差小于5 ppm且碎片離子的相對豐度比在最大允許偏差范圍內時，確證含有該化合物。

對供試品溶液進行Full MS∕dd-MS2全掃描，根據建立的標準篩查數據庫中m∕z的精確分子質量、保留時間和至少有一個碎片離子對目標化合物進行篩查。當未知物出峰時間偏差在 ± 0．5 min內，母離子響應值在105及以上、精確質量數偏差在5 ppm范圍內，子離子響應值在104及以上、精確質量數偏差在5 ppm范圍內，同位素豐度比范圍在70%范圍內，則檢測結果為疑似陽性樣品，否則判定為陰性樣品。

2 結果與討論

2.1 篩查數據庫的建立

根據167種非法添加化學藥物的標準品信息，通過儀器方法分析，自建了167種化合物的基本信息及色譜-質譜信息數據庫（見表1）。

表1 167種化合物的基本信息及色譜-質譜信息Table 1 Basic information and chromatography-mass spectrometry information of 167 compounds

（續表1）

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2.2 色譜條件的優化

考察了多個因素對色譜分離、靈敏度及離子化效率的影響，包括流動相及流動相梯度選擇。由于本文所考察的化合物性質差異較大，含有8對同分異構體，多西環素單鹽酸半乙醇半水合物與鹽酸四環素，潑尼松龍與可的松，磺胺間二甲氧嘧啶與磺胺鄰二甲氧嘧啶，鹽酸萊克多巴胺與鹽酸苯氧丙酚胺，磺胺氯噠嗪與磺胺氯吡嗪，磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪與磺胺間甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶與磺胺二甲異嘧啶，磺胺惡唑與磺胺異惡唑，本實驗首先對流動相的梯度條件、流動相的成分進行考察，以實現目標化合物的最佳分離以及各化合物的良好峰形和最佳響應。考察了乙腈-0．05%甲酸水、0．05%甲酸乙腈-0．05%甲酸水、甲醇-水和乙腈-水分別作為流動相時，不同梯度下目標物在Accucore RP-MS（100 mm × 2．1 mm，2．6 μm）色譜柱上的分離效果。結果顯示，在甲醇-水或乙腈-水中，同分異構體均未能完全分離，與甲醇-水相比，乙腈-水中均加入0．05%甲酸時，增加了化合物的電離效果，大部分待測物的相應靈敏度提高，峰形得到改善；理論上，加入0．1%甲酸時化合物的電離效果會更加明顯，但對于負離子模式的化合物而言，會抑制負離子模式的化合物電離。考慮到目標物在正負離子模式所需的最適溶液pH和當前的靈敏度和峰形均已滿足要求，且上述8對同分異構體均已實現完全分離（見圖1），因此實驗最終選擇0．05%甲酸乙腈-0．05%甲酸水作為最佳流動相，并按“1．3”梯度洗脫條件進行分離。

圖1 8對同分異構體的分離色譜圖Fig．1 Separation chromatograms of 8 pairs of isomers

2.3 質譜條件的優化

對掃描模式、碰撞能、采集點數和動態排除時間進行優化。在選擇掃描采集模式中，根據167種化合物的化學性質，全氟辛酸、氯霉素類和地克珠利以［M - H］-的響應值最高，其他化合物以［M + H］+的響應值最高。由于儀器可提供正、負模式同時掃描，本實驗選擇正、負模式同時掃描對167種化合物進行采集。通常進行二級質譜數據庫的檢索時，低碰撞能量的質譜圖有利于判斷主要碎片，高碰撞能量的質譜圖可得到更多質譜碎片細節，提高化合物的定性準確性，由于實驗涉及的化學物質種類繁多，本文設置了較寬范圍的分步碰撞能，以獲得最適合的碰撞能擊打碎片。在質譜掃描采集點數優化過程中，質譜采集點數以12 ～ 15個為最優，且Chorm peak Width和Smoothing中的Points參數值變大可改善質譜正負模式同時掃描中采集點數不夠的問題，因此實驗將Chorm peak Width參數由15改為30，將Smoothing 中的Points數值從3增至7，以增加采集點數，此時色譜峰形逐漸平滑且趨于正態分布而非平頭峰趨勢（如圖2）。為避免重復采集響應強度占優勢的某一質荷比的母離子的二級質譜，盡可能獲得不同質核比的母離子的二級譜圖，本實驗將動態排除時間縮短（由15 s改為8 s），以增加獲得不同質荷比母離子的二級質譜信息的機率，避免出現漏采集情況。

圖2 譜圖采集點數的比較Fig．2 Comparison of the number of spectral acquisition points

2.4 提取溶劑的選擇

由于本實驗涉及化合物的極性差異較大，且獸藥基質多為水溶性雜質。在參考文獻的基礎上，考察了甲醇、乙腈、0．1%乙酸乙腈、1%乙酸乙腈、0．5%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈、0．5%甲酸乙腈-水（9∶1）作為提取液的提取效果。結果顯示（見圖3），在提取液中加入適當酸可提高化合物的篩查檢出率，且甲酸的效果優于乙酸，但過量的酸度會抑制硝基咪唑類、頭孢類、內酰胺類物質的提取效果。就提取液的顏色而言，0．5%甲酸乙腈提取的樣品溶液顏色較淺，表明色素含量少。在實驗過程中，因為口服液本身含有水分，考慮到待測化合物為水溶性化合物，故在提取液中加入少量水可提高篩查檢出率，滿足實驗要求。本實驗最終選擇0．5%甲酸乙腈-水（9∶1）為提取液。

圖3 不同提取液對添加藥物的篩查結果Fig．3 Screening results of different extract soltions for drug addition

2.5 凈化條件的優化

為有效去除酮、醛、酚等干擾物質的影響，增加對靶標物質定性和定量檢測的準確性，本研究參考畜產品的前處理過程，考察了4種不同品牌和填料的固相萃取小柱（PRiME HLB固相萃取柱、HLB固相萃取柱、EMR固相萃取柱、MCX固相萃取柱）的分離、凈化和富集效果。結果顯示，PRiME HLB和EMR固相萃取柱無需活化、平衡等步驟，可將提取液直接過柱達到凈化目的，但后者需采用比例為4∶1的提取液-水上樣；而HLB和MCX固相萃取柱需經過一系列活化上樣，過程較繁雜。此外，PRiME HLB固相萃取柱對絕大多數化合物的保留性強，洗脫液顏色相較提取液明顯變淺，原因可能為部分色素、生物堿、皂苷等保留在凈化柱上。進一步考察了上樣體積的影響，結果顯示，若上樣體積過低，則待測物可能因洗脫體積小而保留在凈化柱上；加大上樣體積，則雜質目標物同時洗脫出固相萃取柱，導致檢出效果變差。最終選擇5 mL提取液過PRiME HLB固相萃取柱凈化，以獲得最好的實驗效果。

2.6 樣品分析

考察顯示，167種藥物的標準溶液在上機質量濃度為20 ng∕mL時，絕大部分藥物均檢出，頭孢類和內酰胺類藥物在50 ng∕mL時檢出。因基質影響，不同藥物配方非法添加藥物的檢出率略有差異，配方成分復雜的口服液（如：清解合劑、清瘟解毒口服液等）前處理后，藥物檢出濃度高于簡單配方的中藥口服液。如四逆湯樣品以50 ng∕mL上機時絕大部分藥物均可檢出，頭孢他美酯、頭孢匹啉、氨芐西林和哌拉西林等不能檢出的頭孢類藥物和內酰胺類藥物，可在100 ng∕mL上機濃度時檢出；選擇含石膏、金銀花、玄參、黃芩、生地黃、連翹、梔子和龍膽等12種中藥基質成分的清解合劑空白樣品為基質，非法添加藥物在50 ng∕mL水平下（頭孢類和內酰胺類藥物為100 ～ 200 ng∕mL）可定性檢出，其中藥物上機質量濃度為100 ng∕mL時，檢出率為95．81%，藥物上機質量濃度為200 ng∕mL時，藥物檢出率可達100%。依據違法者在中獸藥中主觀添加非法藥物發揮抗病或治療效果的目的，本文的檢測濃度已滿足實際檢測的需要。

3 結 論

本文基于酸性有機溶劑振蕩超聲提取的方式，對不同中獸藥口服液中的167種非法添加化學藥物進行快速測定；采用自建的篩查數據庫比對樣品數據結果，檢出率可滿足分析測定要求；使用UltiMate 3000-Q-Exactive Focus進行分析，精確測得目標物母離子及子離子的分子量、保留時間，降低了測定結果的不準確性。該方法采用Trace Finder篩查軟件建立了167種非法添加化學藥物的高分辨質譜數據庫，可有效實現不同中獸藥基質中非法添加化學藥物的快速檢測，滿足對中獸藥口服液中非法添加物定性篩查的要求，為獸藥企業監控獸藥制劑的質量，以及管理部門加強獸藥質量監控，震懾不法摻假分子提供了技術保障，從源頭上保證了動物源性食品的安全。