利用特征中性丟失和非靶向液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定煙草中的糖苷成分

吳 瓊，汪陽忠，安 彤，沙云菲，石肖楠，費 婷，吳 達，吳 婷*，杜一平

（1．華東理工大學(xué) 分析測試中心，上海 200237；2．上海煙草集團有限責(zé)任公司技術(shù)中心卷煙煙氣重點實驗室，上海 200082）

煙草中的糖類物質(zhì)是影響煙草香氣品質(zhì)的重要化學(xué)成分，包括游離糖（如單糖、低聚糖、多糖等）和結(jié)合態(tài)糖苷（如黃酮糖苷、萜烯糖苷、糖脂等）。糖苷化合物是煙草中非揮發(fā)性香氣的前體物質(zhì)，在煙草的香氣成分中扮演著重要角色［1］。已有大量文獻報道，萜烯類糖苷化合物是煙草中香氣前體物質(zhì)的主要代表，部分組分已被開發(fā)用作煙草中提香的添加劑。黃酮糖苷類物質(zhì)是煙草中大量存在的生物活性物質(zhì)，在吸煙過程中可分解為風(fēng)味相關(guān)的物質(zhì)［2］。糖脂不僅在保潤性能和改善煙葉感官上發(fā)揮作用，更是重要的卷煙香氣前體物質(zhì)［3］。因此，開發(fā)糖苷化合物的定性篩查和定量檢測方法對改善煙草香氣品質(zhì)具有非常重要的意義。

飛速發(fā)展的質(zhì)譜技術(shù)因高靈敏度、高分辨率以及與色譜聯(lián)用的便捷性等優(yōu)勢在未知物結(jié)構(gòu)鑒定中發(fā)揮著不可或缺的作用。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法研究煙草中的揮發(fā)性物質(zhì)，并對其進行結(jié)構(gòu)鑒定及定量分析，主要通過直接分析游離態(tài)香氣成分或間接分析水解后的結(jié)合態(tài)香氣成分來實現(xiàn)［4-5］。液相色譜法對非揮發(fā)性物質(zhì)具有優(yōu)異的分離性能，質(zhì)譜法具有強大的結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析能力，因此，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有無需水解直接分析糖苷類香氣前體物質(zhì)的能力，在糖苷類物質(zhì)分析中占據(jù)重要地位［6-7］。同時，液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)中的串聯(lián)質(zhì)譜方式能提供豐富的二級碎片離子，可為糖苷化合物的結(jié)構(gòu)確認提供有力的結(jié)構(gòu)信息。糖苷化合物中的O-糖苷鍵在質(zhì)譜的碰撞模式下非常容易斷開而獲得失去特定糖元結(jié)構(gòu)的離子片段，可通過高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)利用特征糖元中性丟失來篩選未知糖苷化合物［1-2，8］。文獻報道多數(shù)是針對一類糖苷類物質(zhì)開發(fā)質(zhì)譜分析方法，鮮有對糖苷化合物進行全面篩查和鑒定的研究，特別是鮮有解析糖苷配基結(jié)構(gòu)的研究。

本文提出利用高分辨質(zhì)譜所獲得的特定糖元中性丟失對糖苷化合物進行篩選的方法，同時結(jié)合文獻報道、現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫（mzCloud、HMDB、Lipid Maps等）和碎片離子理論計算工具鑒別煙草中各類糖苷化合物。本方法無需標(biāo)準(zhǔn)物，為煙草中各類糖苷化合物的快速和高通量篩選提供了一種新途徑，為進一步研究煙草中的香氣成分及其影響因素提供了重要信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜-四極桿∕軌道阱組合型質(zhì)譜聯(lián)用儀（Ultimate 3000 & Q-Exactive plus LC-MS，美國賽默飛世爾科技有限公司）；恒溫混勻儀（Thermomixer comfort，美國Eppendorf公司）；臺式高速冷凍離心機（Hitachi CT15RE，日本Hitachi公司）。

甲醇、乙腈和甲酸均為LC-MS級（Fisher金標(biāo)，美國賽默飛世爾科技有限公司）；實驗用水均由Advantage A10超純水機制備（18．2 MΩ·cm，德國默克公司）。

1.2 煙草中糖苷類物質(zhì)的提取

將煙葉磨成粉，稱取20 mg煙葉粉末，加入2 mL 甲醇-水（70∶30，體積比）混合溶液中，70 ℃加熱提取30 min，以5 000 r∕min離心10 min后取上清液，用0．22 μm 聚四氟乙烯（PTFE）濾膜過濾后待分析。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件

煙草提取液的液相色譜分離：采用Hypersil Gold C18色譜柱（2．1 mm × 100 mm × 3 μm，美國賽默飛世爾科技有限公司）。流動相：A為含0．1%甲酸的水溶液，B為含0．1%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脫程序為：0 ～ 4 min，10% ～ 15% B；4 ～ 7 min，15% ～ 25% B；7 ～ 9 min，25% ～ 32% B；9 ～ 16 min，32% ～ 40% B；16 ～22 min，40% ～ 55% B；22 ～ 28 min，55% ～ 95% B，維持2 min；在30．1 min回到10% B并持續(xù)至35 min。

特征中性丟失離子對的采集：采用一級質(zhì)譜采集中的中性丟失模式（ISCID）篩選中性丟失離子對，設(shè)置源內(nèi)裂解能量為5、10、15、20、25、30、35 eV。

非靶向定性分析數(shù)據(jù)采集：糖苷類物質(zhì)的定性分析采用全掃描-數(shù)據(jù)依賴二級質(zhì)譜模式（Full mass-ddMS2），其中一級質(zhì)譜分辨率設(shè)置為70 000，二級質(zhì)譜分辨率為17 500，采集正離子模式數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用數(shù)據(jù)采集和峰提取∕搜庫分別采用Xcalibur軟件和Compound Discoverer 3．2（CD）實現(xiàn)。中性丟失的篩選采用軟件MSFinder（中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所許國旺研究員提供）實現(xiàn)，其中特征中性丟失離子對的保留時間誤差小于0．1 min，中性丟失分子量誤差小于0．01 Da［9］。采用mzCloud （https：∕∕www．mzcloud．org∕）、Lipid Maps（https：∕∕www．lipidmaps．org∕）、HMDB（https：∕∕hmdb．ca∕）等數(shù)據(jù)庫進行化合物的結(jié)構(gòu)檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙草提取液中糖元特征中性丟失的篩查

糖苷化合物在裂解時會丟失一些特征的糖元碎片［10］，本文的特征糖元中性丟失設(shè)置主要考慮戊糖、脫氧己糖、己糖、戊糖-己糖、脫氧己糖-己糖以及己二糖6種糖型，具體的中性丟失分子式和分子量見表1。綜合考慮7種不同源內(nèi)裂解能量（5、10、15、20、25、30、35 eV）下特征中性丟失的母離子-子離子對，在正離子模式下可篩選出所對應(yīng)糖苷類物質(zhì)的質(zhì)荷比信息，共篩選88對具有表1中特征中性丟失的離子（保留時間大于1．5 min）。

表1 中性丟失糖元的詳細信息（RT ＞ 1．5 min）Table 1 Detailed informations of specific neutral loss（RT ＞ 1．5 min）

2.2 煙草提取液的非靶向篩查

圖1為煙草提取液高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析的總離子流圖（TIC）。高分辨質(zhì)譜中含有各種結(jié)合態(tài)糖苷類物質(zhì)的信息，本文主要考察保留時間大于1．5 min，分子量范圍為200 ～ 1 500 Da的結(jié)合態(tài)糖苷。通過Compound Discoverer 3．2軟件進行峰提取和mzCloud數(shù)據(jù)庫搜索，共檢索到1 495種化合物。為篩查煙草中的結(jié)合態(tài)糖苷類物質(zhì)，將本實驗獲得的非靶向篩查中的離子列表與特征中性丟失篩查得到的母離子列表繪制韋恩圖（如圖2），在煙草提取液中共篩選60個符合特征中性丟失的結(jié)合態(tài)糖苷類物質(zhì)。其中部分通過特征中性丟失篩選出的母離子可能為某些二糖糖苷物質(zhì)丟失1個單糖形成的離子，未能在非靶向篩查中找到，因此最終篩選的結(jié)合態(tài)糖苷類物質(zhì)略少于特征中性丟失的母離子數(shù)目。

圖1 煙草提取物的LC-MS總離子流圖（m∕z 200 ～ 1 500 Da）Fig．1 LC-MS TIC of tobacco extract（m∕z 200-1 500 Da）

圖2 特征中性丟失篩查與非靶向篩查得到的母離子數(shù)目的韋恩圖Fig．2 Venn diagram of the numbers of parent ions between neutral loss screening and untargeted screening

2.3 糖苷化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

為進一步確認篩查的結(jié)合態(tài)糖苷化合物的結(jié)構(gòu)，對60種化合物的二級質(zhì)譜圖進行了分析。糖元部分的結(jié)構(gòu)信息可直接通過該化合物的特征中性丟失分子量及其二級譜圖獲取。苷元部分的結(jié)構(gòu)則需利用高分辨二級質(zhì)譜圖推導(dǎo)出相應(yīng)的化學(xué)式，再結(jié)合mzCloud、HMDB、Lipid Maps等數(shù)據(jù)庫和文獻資料確認。

圖3為含有不同苷元的12種代表性糖苷化合物的二級質(zhì)譜圖。O-糖苷通常在糖苷鍵的位置進行斷裂，形成B，Y離子；而C-糖苷則首先從糖元內(nèi)部進行斷裂，形成X，Z離子。因此根據(jù)糖元的特征中性丟失篩選的主要是含有O-糖苷鍵的相關(guān)化合物，而無法篩選出只含有C-糖苷鍵的結(jié)合態(tài)糖苷化合物［11-13］。如表2所示，通過二級質(zhì)譜共鑒定出23種結(jié)合態(tài)糖苷化合物。

圖3 含不同苷元的代表性糖苷化合物的二級質(zhì)譜圖Fig．3 MS∕MS spectra of some typical glycosides in tobacco

表2 煙草中所含有的糖苷化合物可能的結(jié)構(gòu)信息Table 2 Possible structures of screened glycosides in tobacco

（續(xù)表2）

通過mzCloud數(shù)據(jù)庫檢索匹配獲得了4個化合物的定性結(jié)果（ms2best match ＞ 90，表2中化合物3、12、13和17），均為黃酮糖苷類化合物，其中碎片離子m∕z303．048 6是槲皮素苷元的特征峰，碎片離子m∕z287．053 7對應(yīng)的苷元可能為山奈酚。根據(jù)O-糖苷化合物在二級質(zhì)譜圖中特征中性丟失后的苷元離子信息，進一步對其他糖苷化合物進行定性分析。參考文獻中的二級譜圖確認了碎片離子m∕z197．116 5、m∕z269．173 5和m∕z209．152 8所對應(yīng)的苷元為萜烯衍生物。其中m∕z209．152 8對應(yīng)的苷元為氧代紫羅蘭醇，有文獻報道［14］該物質(zhì)為煙草的主要香氣成分之一；m∕z269．173 5對應(yīng)的苷元為3，11，12-Trihydroxy-1（10）-spirovetiven-2-one（HMDB號：0038154）［15］；m∕z197．116 5對應(yīng)的苷元為地芰普內(nèi)酯［16-17］。通過分析化合物19 ～ 22中苷元的元素組成發(fā)現(xiàn)，上述化合物主要由大量碳、氫元素和少量氧元素組成，推測其可能為脂類物質(zhì)，通過Lipid Maps檢索該4種化合物均為固醇脂類（ST）苷元。通過分析二級碎片離子可知，化合物23為神經(jīng)酰胺類（Cer）苷元，其先非特異性丟失1分子水（即［M +H-H2O］+）形成基峰離子，苷元在二級質(zhì)譜圖（圖3L）中可見強度極高的脫水峰（如m∕z696．538 3和m∕z552．498 7）。根據(jù)神經(jīng)酰胺骨架中進一步斷開酰胺鍵丟失1分子中性脂肪酸烯酮，可推斷化合物23的苷元是由C16∶0的羥基脂肪酸和C18∶2的羥基醇胺脂肪鏈連接而成的Cer 34∶2。圖4為化合物23中苷元可能的裂解路徑。

圖4 化合物23的二級碎裂路徑Fig．4 Fragmentation of compound 23

綜上所述，在煙草提取液中共鑒定出23種結(jié)合態(tài)糖苷化合物，包括酚酸、黃酮、生物堿、萜烯、固醇脂及神經(jīng)酰胺類苷元結(jié)構(gòu)。根據(jù)化合物極性的不同，可發(fā)現(xiàn)極性較大的酚酸類糖苷出峰較早，保留時間基本在8 min之前（見圖1）；中等極性的黃酮糖苷和糖苷生物堿類化合物基本位于色譜圖的中間位置，保留時間為8 ～ 18 min；弱極性的糖脂化合物最后被洗脫，保留時間為18 ～ 30 min。表2中的糖苷物質(zhì)通過二級質(zhì)譜確定全部是O-糖苷物質(zhì)，主要包括單糖苷、二糖苷和三糖苷。在篩選出表1中列舉的糖元相關(guān)的糖苷時，其氨基糖元和乙基胺糖元同樣被篩選出來（表2中化合物1、10和19）。

3 結(jié) 論

根據(jù)高分辨質(zhì)譜可準(zhǔn)確鑒別分子碎片的特點，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合糖元特征中性丟失篩查技術(shù)，建立了煙草中糖苷類物質(zhì)的快速鑒定方法，共篩選出60種糖苷類物質(zhì)，并針對其中23種進行了結(jié)構(gòu)確認。所篩查的糖苷類物質(zhì)主要包括單糖苷、二糖苷和三糖苷，糖元部分以己糖、脫氧己糖以及兩者的二糖或三糖為主。利用多種數(shù)據(jù)庫檢索方法，并參考文獻資料進一步對苷元部分的結(jié)構(gòu)進行確認，發(fā)現(xiàn)它們屬于酚酸類、黃酮類、生物堿類、萜烯類、固醇脂類及神經(jīng)酰胺類化合物等。本文所鑒定的糖苷類物質(zhì)種類豐富，對煙草中香氣組分研究具有重要的參考價值，為進一步研究煙草香氣的影響因素奠定了基礎(chǔ)。