溶劑誘導(dǎo)萃取/UPLC-MS/MS法高通量檢測(cè)環(huán)境水體中12種除草劑

陳 靜，王 波，王新潮，王 娟，王玉新，諶 越，瞿德業(yè)*

（1．西北師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2．甘肅省綠洲資源環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3．蘭州海關(guān)技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730070）

除草劑是指能殺死雜草或有害植物，而不影響農(nóng)作物正常生長(zhǎng)的化學(xué)藥劑，可用于防治農(nóng)田雜草或殺滅非農(nóng)耕地的雜草或灌木［1］。除草劑被廣泛應(yīng)用于稻谷、水果、蔬菜等種植業(yè)中，造成了稻谷、水果、蔬菜、水體及土壤中除草劑及其代謝物的殘留［2］。殘留的除草劑通過生物積累和擴(kuò)散到食物鏈中，對(duì)人體健康構(gòu)成威脅。因此，除草劑殘留造成的傷害不容忽視。目前，除草劑殘留的檢測(cè)方法主要包括氣相色譜法（GC）［3］、液相色譜法（LC）［4-5］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS∕MS）［6］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS∕MS）［7］等。其中，氣相色譜法在果蔬農(nóng)藥殘留檢測(cè)中應(yīng)用較廣，檢測(cè)范圍較寬，但不適用于檢測(cè)難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的化合物［8］；液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在除草劑高通量檢測(cè)中的應(yīng)用較少；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)。

在農(nóng)藥殘留分析中，樣品前處理所需時(shí)間通常占分析時(shí)間的61%，并對(duì)分析的可靠性和準(zhǔn)確性起至關(guān)重要的作用，因此前處理是分析檢測(cè)的重要環(huán)節(jié)［9］。除草劑殘留的常規(guī)前處理方法有液液萃取、固相萃取、固相微萃取、凝膠滲透色譜等技術(shù)［10-11］，以上前處理方法操作時(shí)間長(zhǎng)［12］，且操作過程復(fù)雜，制約因素多，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的動(dòng)手能力要求高。溶劑誘導(dǎo)萃取技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)為經(jīng)萃取劑誘導(dǎo)分離的乙腈層和水層能夠?qū)⑹杷院陀H水性物質(zhì)在線分離，從而實(shí)現(xiàn)樣品的凈化和濃縮，且有機(jī)相與反相UPLC流動(dòng)相兼容，可直接進(jìn)樣分析［13］。本研究基于乙腈與水互溶，在勻相的乙腈-水體系中添加一種疏水且與乙腈互溶的有機(jī)溶劑，從而誘導(dǎo)乙腈-水體系分層的原理，建立了一種溶劑誘導(dǎo)萃取∕超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS∕MS）同時(shí)檢測(cè)環(huán)境水體中12種除草劑的方法。該方法靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，前處理耗時(shí)短，為環(huán)境水體中除草劑的高通量檢測(cè)提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）；多管渦旋混合儀（美國(guó)Scientific Industries）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；移液槍（美國(guó)Thermo Electron公司）。

乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲酸銨、二氯甲烷、三氯甲烷、氯化鈉、甲酸（純度 ＞98%）；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水（屈臣氏），12種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg∕L，阿爾塔科技有限公司）。

12種除草劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各1．0 mL，用乙腈-水（體積比1∶1）定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成1．0 mg∕L的12種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，冷藏待用。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確量取10 mL水樣，加入等體積乙腈，渦旋5 min后，加入1．0 mL二氯甲烷，渦旋5 min后靜置3 min。在6 ℃下以10 000 r∕min離心7 min，乙腈-水溶液分層，上層為乙腈層，下層為水層，記錄上下層體積。分別取1．0 mL過0．22 μm有機(jī)濾膜，濾液裝入棕色進(jìn)樣瓶，待測(cè)。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm × 2．1 mm，1．8 μm，美國(guó)Agilent公司）；流動(dòng)相A：0．1%甲酸水；B：乙腈（0．1%甲酸水）；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：30 ℃；流速：0．30 mL∕min。流動(dòng)相洗脫梯度：0 ～ 1 min，30% B；1 ～ 2 min，30% ～ 50% B；2 ～ 9 min，50% B；9 ～9．5 min，50% ～ 30% B；9．5 ～ 10 min，30% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子方式掃描，電噴霧離子源（ESI），毛細(xì)管電壓為3 500 V；霧化氣壓力為275．8 kPa；干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流速為10 L∕min。經(jīng)優(yōu)化后，12種除草劑的定性定量離子對(duì)、保留時(shí)間、碰撞能量及碎裂電壓見表1。

表1 12種除草劑的保留時(shí)間以及MRM參數(shù)Table 1 Retention times and MRM parameters of 12 herbicides

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 萃取劑的選擇萃取劑是決定萃取效率的關(guān)鍵因素，選擇合適的萃取劑需考慮萃取劑的密度、揮發(fā)性、對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的萃取能力以及對(duì)后續(xù)色譜分離分析的影響［14］。與乙腈互溶的疏水性溶劑均能作為萃取劑誘導(dǎo)乙腈-水體系分層［13］，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不含氧萃取劑（如二氯甲烷）、無(wú)機(jī)鹽（如NaCl）以及不常用的三氯甲烷3種萃取劑的效果。在空白水樣中添加12種除草劑混合標(biāo)樣，按照“1．2”處理，比較乙腈層中12種除草劑的含量，并通過計(jì)算回收率確定12種除草劑的轉(zhuǎn)移率（圖1）。結(jié)果表明，以二氯甲烷為萃取劑時(shí)，目標(biāo)物的回收率最高，因此選擇二氯甲烷作為萃取劑。

圖1 不同萃取劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig．1 Effects of different extractants on the recoveries of target compounds

2.1.2 萃取劑體積的選擇考察了萃取劑二氯甲烷的體積對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響。在其他條件一致的情況下，配制10 μg∕L空白加標(biāo)水樣，分別添加不同體積（0．8、1．0、1．2、1．5 mL）的二氯甲烷，按照“1．2”處理后上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，二氯甲烷體積為1．0 mL時(shí)，12種除草劑的回收率總體最高，因此選擇二氯甲烷體積為1．0 mL。

2.1.3 提取劑體積的選擇以乙腈為提取劑，考察了不同體積乙腈對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，分別取4．0、6．0、8．0、10、12、14、16 mL乙腈，按照“1．2”處理后上機(jī)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物主要集中在上層乙腈層，因此主要比較上層物質(zhì)的回收率。發(fā)現(xiàn)乙腈體積為10 mL時(shí)目標(biāo)物的出峰效果最好，回收率較高，因此選擇乙腈體積為10 mL。

2.1.4 離心時(shí)間的選擇為使二氯甲烷的萃取效果更顯著，在其他條件一致的情況下，配制10 μg∕L空白加標(biāo)水樣，考察了離心時(shí)間（5、6、7、8、9、10 min）對(duì)12種除草劑回收率的影響，按照“1．2”處理后上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，離心時(shí)間在5 ～ 7 min時(shí)目標(biāo)物的回收率增加較快，離心時(shí)間在7 ～ 10 min時(shí)目標(biāo)物的回收率下降，因此選擇離心時(shí)間為7 min。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果由“2．1”結(jié)果可知，以二氯甲烷作為萃取劑時(shí)12種除草劑的萃取效果最好，且乙腈體積為8．0、10、12 mL時(shí)目標(biāo)物的回收率較好。因此，通過極差對(duì)單因素水平進(jìn)行篩選，最終選擇提取劑乙腈體積、萃取劑二氯甲烷體積、離心時(shí)間為考察因素，通過響應(yīng)面法對(duì)3個(gè)單因素進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

利用Design Expert10軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。由表3可知，乙腈體積（P＜ 0．01）和二氯甲烷體積（P＜ 0．01）對(duì)12種除草劑回收率的影響極顯著。以12種除草劑的回收率為響應(yīng)值，經(jīng)擬合得到回歸方程：Y= 95．60 + 4．86A - 9．87B - 2．69C - 0．93AB + 1．40AC - 0．075BC - 9．08A2- 14．80B2- 9．42C2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)方差分析結(jié)果，該模型的相關(guān)系數(shù)（r2）為0．983，說明模型的可信度高。該模型達(dá)到極顯著水平（P＜ 0．01），表明該二次模型能夠擬合實(shí)際結(jié)果，誤差較小，可利用此回歸方程確定12種除草劑的最佳萃取條件。由表3還知，A、B、A2、B2、C2對(duì)12種除草劑的回收率產(chǎn)生極顯著影響（P＜ 0．01），而AB、AC、BC對(duì)目標(biāo)物回收率的影響不顯著。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖見圖2。響應(yīng)面圖可較直觀地顯示各因素交互作用對(duì)除草劑回收率的影響，曲線越陡峭，則表明該因素的影響越大［15］。由表3及圖2可見，二氯甲烷體積對(duì)除草劑回收率的影響最大，乙腈體積、二氯甲烷體積、離心時(shí)間之間的交互作用對(duì)目標(biāo)物回收率的影響不大。根據(jù)軟件計(jì)算結(jié)果，預(yù)測(cè)12種除草劑的最佳回收率為97．8%，乙腈體積為10．7 mL，二氯甲烷體積為1．1 mL，離心時(shí)間為6．9 min。將上述條件簡(jiǎn)化為乙腈體積10 mL、二氯甲烷體積1．0 mL、離心時(shí)間7 min，進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到12種除草劑的平均回收率為96．5%，測(cè)定結(jié)果與理論結(jié)果較一致。因此確定乙腈體積為10 mL，二氯甲烷體積為1．0 mL，離心時(shí)間為7 min。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig．2 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

2.3 儀器條件的優(yōu)化

2.3.1 質(zhì)譜參數(shù)的選擇將質(zhì)量濃度為100 μg∕L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液采用正離子模式掃描，選擇峰強(qiáng)度較大的離子作為定性和定量離子。根據(jù)選擇的離子對(duì)優(yōu)化去簇電壓和碎裂電壓，再對(duì)電噴霧電壓、離子源溫度和駐留時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳質(zhì)譜條件如“1．3．2”所示。雖然各離子的色譜圖會(huì)有重疊，但各峰的定量離子和定性離子不同，因此不影響定量分析［16］。通過梯度洗脫可實(shí)現(xiàn)多種化合物的有效分離，且峰形較好。12種除草劑的總離子流圖如圖3所示。

圖3 12種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg∕L）的總離子流圖Fig．3 Total ion chromatogram of 12 herbicides mixed standard solution（100 μg∕L）

2.3.2 色譜柱的選擇比較了ACQUITY UPLCTMBEH C18（1．0 mm × 50 mm，1．7 μm）和ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm × 2．1 mm，1．8 μm）兩款色譜柱對(duì)12種化合物分離效果的影響。結(jié)果顯示，使用后者能使12種目標(biāo)物的峰形對(duì)稱，色譜響應(yīng)較高。該柱適用于高壓條件下操作（高達(dá)60 MPa），且裝填了高性能的微粒C18填料可用于高速反相HPLC，對(duì)所有類型化合物分析均能得到高柱效和優(yōu)異峰形。因此選用ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm × 2．1 mm，1．8 μm）色譜柱。

2.3.3 流動(dòng)相的優(yōu)化由于待測(cè)化合物均在正離子模式下進(jìn)行檢測(cè)，理論上母離子大部分是H+、和Na+，因此在流動(dòng)相中加入甲酸或乙酸銨可以提高待測(cè)物的離子化效率，提高質(zhì)譜響應(yīng)［17］。考察了水（0．01%甲酸水 + 2 mmol∕L甲酸銨）-甲醇（0．01%甲酸水 + 2 mmol∕L甲酸銨）、0．1%甲酸水-甲醇（0．01%甲酸水 + 2 mmol∕L甲酸銨）、0．1%甲酸水-乙腈、0．1%甲酸水-乙腈（0．1%甲酸水）4種流動(dòng)相對(duì)12種除草劑分離效果的影響。結(jié)果顯示，以0．1%甲酸水-乙腈（0．1%甲酸水）為流動(dòng)相時(shí)，所有目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度最高，出峰時(shí)間最短，因此選擇該流動(dòng)相進(jìn)行分離。

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

用乙腈-水（1∶1）配制0．05、0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、20．0、50．0 μg∕L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，以各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg∕L），對(duì)應(yīng)的峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，12種除草劑在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0．999 5。以3倍信噪比計(jì)算得到目標(biāo)化合物的檢出限（LOD）為0．05 ～ 0．5 μg∕L，以10倍信噪比計(jì)算得到目標(biāo)化合物的定量下限（LOQ）為0．2 ～ 5．0 μg∕L（見表4）。

表4 12種除草劑的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 4 Linear relations，detection limits and quantitation limits

2.5 準(zhǔn)確度與精密度

選擇空白水樣準(zhǔn)確加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成0．5、5、50 μg∕L的加標(biāo)樣品，按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行處理和測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度和精密度。由表5可知，3個(gè)加標(biāo)水平下12種除草劑的回收率為83．0% ～ 110%，RSD為0．30% ～ 5．0%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度較好。

表5 加標(biāo)水樣的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n = 5）Table 5 Average recoveries and relative standard deviations of spiked water samples（n = 5）

2.6 與標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

與GB∕T 5750．8-2006 《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 有機(jī)物指標(biāo)》［18］和GB∕T 23214-2008 《飲用水中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定》［19］標(biāo)準(zhǔn)方法相比，本方法前處理只需乙腈、二氯甲烷2種試劑，而標(biāo)準(zhǔn)方法需使用乙腈、無(wú)水乙酸鈉、無(wú)水硫酸鎂、甲苯等多種試劑，成本升高；本方法只需渦旋、離心、分層、進(jìn)樣，操作簡(jiǎn)單，有利于進(jìn)行高通量、快速的樣品處理，且對(duì)操作要求較低；本方法前處理僅耗時(shí)30 min，標(biāo)準(zhǔn)方法的前處理時(shí)間為本方法的2 ～ 3倍；本方法的檢出限最高為0．5 μg∕L，而標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限最高為34．37 μg∕L。綜上，本方法試劑用量少，操作簡(jiǎn)單，前處理耗時(shí)短，靈敏度高。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

為驗(yàn)證本方法的實(shí)用性，采集湖水、河水、二次供水、飲用水、農(nóng)田灌溉水各10份共50份樣品，采用本方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在實(shí)際樣品中檢出莠滅凈、氰草津、氯磺隆，其中河水中檢出4．2 μg∕L氰草津，湖水中檢出3．6 μg∕L莠滅凈，農(nóng)田灌溉水中分別檢出5．3 μg∕L莠滅凈、6．5 μg∕L氰草津和15．8μg∕L氯磺隆。特別是農(nóng)田灌溉水，氯磺隆的檢出率高達(dá)30%，這可能是由于農(nóng)田中除草劑的使用頻率較高，一部分除草劑會(huì)滲透到土壤中，灌溉農(nóng)田時(shí)再次溶入水中；氯磺隆的殘留期長(zhǎng)，所以在農(nóng)田灌溉水中檢出濃度較高，應(yīng)多給予關(guān)注。二次供水、飲用水中均未檢出12種除草劑。

3 結(jié) 論

本文通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析得到最優(yōu)的前處理?xiàng)l件，建立了測(cè)定環(huán)境水樣中12種除草劑的溶劑誘導(dǎo)萃取∕UPLC-MS∕MS法。12種除草劑的回收率為83．0% ～ 110%，RSD為0．30% ～ 5．0%，檢出限為0．05 ～ 0．5 μg∕L，定量下限為0．2 ～ 5．0 μg∕L，方法學(xué)指標(biāo)均能滿足檢測(cè)要求。溶劑誘導(dǎo)萃取技術(shù)不僅能夠提高檢測(cè)通量，而且試劑用量少，能夠在線完成凈化和富集，操作簡(jiǎn)單，前處理用時(shí)少，有效降低了實(shí)驗(yàn)成本。該方法可為除草劑或農(nóng)藥殘留的高通量檢測(cè)提供新思路。