短鏈脂肪酸在動物樣本中的檢測方法研究進展

劉娜 焦京琳 饒正華

（中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 動物營養學國家重點實驗室，北京 100193）

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），又稱揮發性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA），是腸道內未消化的復合碳水化合物被結腸厭氧微生物發酵的主要代謝終產物［1］。其由碳鏈為1-6的有機羧酸構成，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和己酸等，SCFAs可降低畜禽胃腸道內容物的pH 值，抑制病原菌的生長，同時促進養分的吸收［2］。通常情況下，動物的SCFAs來源有兩個方面，一是直接通過外源獲取，二是通過后腸微生物的發酵產生，后者也是動物獲取SCFAs的主要方式［3］。SCFAs作為營養物質通過瘤胃或腸道上皮細胞被吸收，為反芻動物提供大部分代謝能量需求［4］。在瘤胃液內的含量高達90-150 mmol/L，其中約80%的SCFAs在反芻動物瘤胃和網胃內被吸收，剩余的SCFAs主要在瓣胃和皺胃吸收［5］。對非反芻動物來說，SCFAs主要是膳食纖維通過微生物在結腸（豬）或盲腸（禽）發酵合成，是腸道上皮細胞的主要能量物質，為其提供60%-70%的能量需求，是維持動物腸道健康的重要物質［6］。SCFAs可維持動物腸道內環境穩態，促進腸道的消化吸收，激活腸道免疫應答，調節細胞分化與凋亡，調節機體的脂質代謝及糖代謝［7］。在動物健康和飼料營養研究中短鏈脂肪酸的濃度越來越受到關注，因此SCFAs的檢測方法凸顯尤為重要。

動物樣本和人體樣本不盡相同。目前更多的檢測方法是應用在人體糞便中，而關注動物樣本檢測方法優化的研究略少。SCFAs 是一類半衰期短、代謝快的揮發性化合物。不同的生物樣本中SCFAs的前處理方法不同，糞便中前處理常見有蒸餾法、高速離心法及超濾法等；常用檢測方法包括氣相色譜法、液相色譜法、毛細管電泳法等。本文綜述了近幾年來不同動物樣本中SCFAs 檢測主流的前處理和儀器分析方法，對比各方法的利弊，以期為SCFAs在動物樣本中檢測提供理論參考。

1 前處理

1.1 不同動物樣本前處理方法

1.1.1 動物糞便樣本 由于腸道中SCFAs的組成與宿主腸道菌群直接關聯，所以動物腸道菌群的研究中常常檢測動物的糞便樣本［8-9］。SCFAs 具有自身極性大、揮發性強、水溶性大的特點使樣本快速處理尤為重要，常規的蒸餾、衍生化、萃取等方法耗時、耗有機試劑、污染大，因此在分離效果好的基礎上需要簡單、準確且快速直接的前處理方法［10］。動物糞便樣本的前處理方式較人體樣本相對簡單。在養殖場采集新鮮糞便后用低溫轉運箱運送到實驗室進行檢測，同時可備份樣品在-80℃下冷凍保存。一般動物糞便樣本前處理包括提取和低溫高速離心，隨后取上清液過膜進樣。提取時可以采用蒸餾水或鹽酸溶液，其中鹽酸可以用5%濃度［11］或0.1%濃度［12］等；蒸餾水可以與樣本量等體積［13-15］，可以8倍體積［16-17］等，然后超聲20 min。蔣愷憧等［1］比較了酸（鹽酸溶液，pH 2）提取法和水（滅菌去離子水）提取法對于犢牛和小鼠的新鮮糞便中SCFAs的測定，結果表明2種方法均可檢測到6 種SCFAs，且水提法的SCFAs 檢測濃度高于酸提法，但無顯著性差異。樣本提取后一般采用4℃高速（離心力10 000 ×g以上）離心至少10 min后取上清液待測。

1.1.2 動物腸道樣本 乙酸、丙酸和丁酸在豬的結腸短鏈脂肪酸中占據85%甚至更高的比例［18-19］。動物腸道內SCFAs的濃度主要取決于動物腸道內微生物群組成、飼糧中纖維的含量、飼料在腸道內的消化時間以及宿主與微生物的代謝通量。研究表明飼糧纖維水平可通過調節腸道微生物從而顯著影響宿主的腸道健康，而這一過程可能源于纖維在后腸發酵產生SCFAs模式和濃度的差異［20］。不同纖維來源非淀粉多糖也會改變動物腸道中短鏈脂肪酸的種類和數量。Pieper等［21］在仔豬日糧中添加了麥麩和甜菜堿，發現豬結腸中乙酸的比例從58%增至62.7%，丙酸比例從25.7%降至23%。因此，研究學者常常通過動物腸道中短鏈脂肪酸的濃度變化來開展飼料營養與動物健康方面的研究。

動物腸道樣本在前處理過程中常用水提取。研究學者發現豬回腸食糜可以采用等體積雙蒸水提取［22］，肉雞盲腸食糜可以用兩倍體積生理鹽水提取［23］，肉兔盲腸內容物采用蒸餾水稀釋10倍提取［24］，白鵝盲腸（半固體狀）采用兩倍體積蒸餾水稀釋提取［25］。提取后進行低溫高速離心，再加入25%偏磷酸（也可以是25%偏磷酸-巴豆酸）溶液混勻，隨后可以-20℃冰箱中過夜，也可以在冰水浴中放置半小時以上，最后低溫高速離心去除蛋白質沉淀物，取上清液過膜進樣。

1.1.3 動物瘤胃樣本 反芻動物為復胃動物，其中瘤胃是最大的胃，掌握反芻動物瘤胃中短鏈脂肪酸濃度對監測動物身體狀況、調整營養水平、提高動物機體免疫力等具有重要意義［26］。瘤胃液的采集一般是用胃管式瘤胃采樣器，采集后裝于凍存管中并迅速置入液氮罐中冷凍，再帶回實驗室-80℃保存。研究學者在處理牛和羊的瘤胃液樣本時前處理操作相對簡單。離心可以清除瘤胃液中的顆粒物，牛瘤胃液可以先低速（6 000×g）離心10 min后再取上清液繼續高速（14 000×g）離心10 min［27］，也可以直接高速（20 000×g）離心25 min取上清液［28］或16 100×g下離心30 min取上清液［29］。羊的瘤胃液同樣可以先低速（轉速5 400 r/min）離心10 min取上清液［30］。離心后的上清液均需要加25%偏磷酸混勻后再次低溫高速離心后取上清液待測［31-33］。目前瘤胃液中短鏈脂肪酸也有團體標準《T/NAIA 005-2020》可以參考，同樣用25%偏磷酸除去可溶性蛋白質后10 000 r/min離心10 min后上清液過膜直接進樣。

1.2 內標物的選擇

在短鏈脂肪酸含量測定時常使用內標化合物。用內標法測定時需在樣品中加入一種物質作內標，而內標物應符合以下條件：（1）應是樣品中不存在的純物質；（2）內標物質的色譜峰位置，應位于被測組分色譜峰附近或在幾個被測組分色譜峰中間，且與這些組分能完全分離；（3）其物理性質及理化性質應與被測組分相近；（4）加入的量應與被測組分含量接近［34-35］。因此根據內標物的選擇原則并結合實驗室已有物質，短鏈脂肪酸測定時可選用異己酸［27］、4-甲基戊酸［28］、巴豆酸及丙二酸［30］、2-乙基丁酸（2EB）［31-33］、2-甲基丁酸［36］等為內標物質。

1.3 同位素示蹤法

動物大腸中發酵產生的部分短鏈脂肪酸在腸道被吸收，供機體利用，而未被吸收利用的則隨著大腸內容物以糞便的形式排出體外［37］，因此有學者關注短鏈脂肪酸在動物體內的去向研究，常利用同位素示蹤法測定短鏈脂肪酸。同位素示蹤劑對動物灌注常采用13C標記。Markantonatos等［38］將13C-乙酸鈉鹽、13C-丙酸鈉鹽和13C-丁酸鈉鹽注入荷斯坦母牛瘤胃中進行短鏈脂肪酸測定，瘤胃液前處理時同樣加入偏磷酸后低溫高速離心。張博等［37］利用［13C］-VFA（乙酸、丙酸、丁酸）穩定性同位素灌注法，跟蹤豬大腸內產生的VFA 的去向，前處理時將大腸腸道組織用液氮研磨，隨后用超純水溶解并稀釋，超聲提取，隨后高速離心取上清液待測。

1.4 衍生化法

衍生化是將一些難于分析檢測的物質轉化為穩定且易于分析的物質。羧基的極性比較強，在氣相色譜柱中易產生吸附從而使結果的重現性差，尤其在濃度低（<1 mmol/L）時發生［39］。而在液相系統中短鏈脂肪酸又缺乏合適的發色基團。因此短鏈脂肪酸檢測中常需要進行柱前衍生化，主要是通過增加結構中的發色基團提高紫外檢測器等的響應，或者是通過降低其揮發性避免分析過程中短鏈脂肪酸的逸失，使測定結果更加精準［40］。羥基、羧基、胺、硫醇、磷酸鹽等官能團在氣相色譜分析高溫環境下可能不穩定，因此需要通過某些硅基化試劑進行衍生化［41］。衍生化可以提高化合物穩定性、靈敏度及分離度。常用的衍生試劑有吡啶［42］、氯甲酸丙酯［43］、硝基苯肼等［44］。對樣品進行簡單的酸化也是短鏈脂肪酸測定中常用的方法，主要包括鹽酸、偏磷酸、甲酸、高氯酸等［45-48］，可以減少峰拖尾現象，也有利于脫蛋白，起到除雜質和提高分離度的作用。同時短鏈脂肪酸為酸性化合物，在溶液中有離子型和游離型兩種狀態，加入偏磷酸可使短鏈脂肪酸處于游離態，有利于測定［49］。

2 儀器分析方法

2.1 氣相色譜

1952年首次報道了利用氣相色譜檢測短鏈脂肪酸［50］。目前利用氣相色譜分析短鏈脂肪酸也是最常見的技術手段之一，儀器可靠性高，操作簡單。在色譜柱的選擇上，通常采用毛細管柱，利用相似相溶原則選擇合適固定相的色譜柱。常用的色譜柱有DB-FFAP［10，36］、Inter Cap Wax［1］、SH-Stabilwax［51］等。檢測器通常選用火焰離子化檢測器（FID）。FID是用氫氣在空氣中燃燒所產生的火焰使被測物質離子化。氣相色譜檢測短鏈脂肪酸時需要設置升溫程序，一般采用分流進樣。

對于反芻動物瘤胃液成分雜質較多，對儀器的進樣口和色譜柱會造成一定程度污染，降低分析的準確性，也縮短了色譜柱的使用壽命［52］。一些學者也利用頂空進樣法對復雜基質中短鏈脂肪酸進行測定［53-54］。王俊紅等［51］分析奶牛和湖羊的瘤胃液中短鏈脂肪酸時，利用頂空-氣相色譜法檢測，無需樣品前處理過程，稱取一定量樣品放入頂空瓶中，在85℃平衡預熱30 min后取平衡氣體直接進行測定。頂空進樣需要在氣相色譜上配備頂空進樣裝置，節約了樣本前處理的時間，有效降低了樣品中雜質對色譜柱的污染［55］。氣相色譜操作簡單，前處理方法也無需衍生化，但儀器程序升溫需要單獨消耗時間，儀器運行時間大約20 min，且靈敏度上不如質譜聯用儀器高，適合動物樣本中短鏈脂肪酸濃度高的樣品檢測。

2.2 氣相色譜串聯質譜

氣相色譜串聯質譜法是在氣相色譜基礎上，樣品中各組分經氣相色譜分離后，質譜作為其檢測器，先將被測物質離子化，根據離子的質荷比進行分離，測定各種離子譜峰的強度而實現分析目的［56］。質譜法較單純色譜法相比不光能定量，還能更準確地對短鏈脂肪酸進行定性，并有效減少干擾峰，且靈敏度也大大提升，同時氣質儀器還有用相應的質譜譜庫。Douny等［57］利用GC-MS全掃模式，質量范圍在40-150 Da下檢測豬體外模擬胃腸道模型中短鏈脂肪酸。Bianchi等［58］同樣用GC-MS全掃模式，質量范圍在35-150 amu下檢測短鏈脂肪酸含量。氣相色譜串聯質譜儀較氣相色譜在靈敏度上有所提升，而且有譜庫可以比對，沒有標準品情況下也能對樣品中短鏈脂肪酸進行定性，但前處理步驟也相對復雜，分析時間上同氣相一樣儀器基本也運行20 min。

2.3 液相色譜

液相色譜原理是流動相與檢測物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由于被測物中不同物質與固定相的相互作用力不同，不同的物質先后被洗脫，通過檢測器得到不同的峰信號，最后通過分析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質。利用液相色譜檢測短鏈脂肪酸，常用紫外檢測器。但由于SCFAs的極性和揮發性，以及缺乏合適的發色團，使得SCFAs的提取和在紫外檢測中有信號變得更加困難。一般需要用酸性流動相且用硝基苯肼等衍生化。流動相組成中水相可以用20 mmol/L NaH2PO4溶液（pH 2.2）［59］、高氯酸溶液（pH 2.1）［60］、磷酸溶液（pH 2.5）［61］等，有機相一般用乙腈溶液。檢測波長可以選210 nm［59-60］或400 nm［61］。液相色譜檢測雖提升了靈敏度，但需要衍生化，增加了實驗步驟，且強酸流動需要注意維護色譜柱。

2.4 液相色譜串聯質譜

為了提高短鏈脂肪酸的靈敏度，科學家也開發了利用液相色譜串聯質譜的檢測方法。短鏈脂肪酸類化合物在質譜中響應很低，且高親水性及極性特點導致其在反相色譜柱上保留很弱，因此常采用衍生化法進行測定。離子源通常采用大氣壓電噴霧離子源（ESI源），掃描模式是ESI+［62］。流動相中水相可以采用0.1%甲酸水［63］，10 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸）［64］等；有機相選擇乙腈［65］，0.1%甲酸甲醇等溶液進行梯度洗脫。研究表明衍生劑添加的官能團可以通過在電噴霧離子源中更有效地電離，或在碰撞池中更容易地碰撞誘導解離，產生獨特和高度豐富的特征片段離子來潛在地提高靈敏度［64］。衍生化試劑可以選擇4-AMBA［63］，0.1 mol/L甲醇中丁基羥基茴香醚（BHA）溶液和甲醇中0.25 mol/L 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）［64］，d0/d6-鄰苯二甲酸二庚酯（d0/d6-DHPP）試劑等［65］。液相色譜串聯質譜縮短了檢測時間，大大提高了靈敏度，同時能檢測多種脂肪酸，但同樣需要衍生化，需要購買合適的衍生化試劑以完成檢測。

2.5 離子色譜

離子色譜是分析陰離子和陽離子的一種液相色譜，它是利用物質在離子交換柱上遷移的差異而達到分離，用于親水性陰陽離子的測定。離子色譜的分離原理主要是離子交換，基于離子交換樹脂上可離解的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子之間進行的可逆交換，不同離子因與交換劑的親和力不同而被分離，與液相色譜不用的是，離子色譜選擇性的改變主要是通過不同的固定相來實現的［56］。離子色譜可以識別以下陰離子：甲酸、醋酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、庚酸酯和辛酸酯［66］。樣品需要被氧化，產生的有機陰離子進行收集。可以采用不同濃度的硫酸溶液和硫酸/丙酮溶液作為洗脫液［67］。Wu等［16］和Liu等［17］測定斷奶小豬消化物時均利用離子色譜檢測。離子色譜檢測時前處理過程中需要添加試劑以實現氧化，因此增加了前處理步驟。

3 總結與展望

短鏈脂肪酸是維持動物腸道平衡的重要代謝產物，在動物體內能參與不同器官的代謝，因此其檢測方法尤為重要。動物樣本涉及的基質類型相對人體樣本多，其檢測前處理技術上普遍采用低溫高速離心后直接上樣。儀器方面主要應用色譜及色譜質譜聯用技術，各項檢測技術各有利弊，根據樣品濃度高低的要求，以及實驗室自身儀器裝備來選擇不同的檢測技術。由于短鏈脂肪酸類化合物具有極性大、揮發性強及水溶性大的特點增加了其檢測難度，因此為了提高檢測的靈敏度常采用衍生化的方法，根據使用儀器的不同需要采用不同的衍生化試劑。

未來短鏈脂肪酸在動物樣本中檢測方法的開發中，應結合現在高分辨質譜的優勢，在不衍生化，盡量少前處理步驟的條件下進行研發。目前高分辨質譜技術崛起，具有高分辨率、高靈敏度和高準確度的儀器為未來檢測帶來無限可能。