STAT3/iNOS通路在慢性阻塞性肺疾病伴氣道重塑中的作用▲

喬 迪 胡 赤 吳 玨 李秋艷 吳 濤 樊 君

(1 昆明同仁醫院呼吸內科，云南省昆明市 650228； 2 中國人民解放軍聯勤保障部隊第920醫院心血管內科，云南省昆明市 650024 )

隨著社會工業化和人口老齡化的加劇，慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的患病率顯著上升，其已成為全球最主要的死亡病因之一，也是我國第三大死亡病因[1]。由于氣道和肺部長期受到有害顆粒或氣體的刺激，肺部及支氣管中異常炎癥反應增強，這最終導致COPD的發生，嚴重者可危及生命[2]。其中，卷煙煙霧中的有害顆粒和氣體是引起COPD的主要危險因素[3]。信號傳導子及轉錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)/誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)信號通路可調控多種生物進程[4]，其中iNOS作為STAT3的下游因子，可進一步促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平升高，引起氣道壁增厚，進而導致氣道重塑，引起COPD的發生[5]。有學者發現，補肺益腎方可能夠通過抑制STAT3的磷酸化，從而改善COPD[6]。而iNOS是治療嚴重肺氣腫和肺動脈高壓的潛在新靶點之一[7]。但是，STAT3/iNOS通路在COPD氣道重塑中的作用機制如何，相關研究較少。本研究構建COPD大鼠模型，并使用STAT3特異性抑制劑Stattic進行干預，同時使用含3.0%香煙煙霧提取物的細胞培養基誘導支氣管上皮細胞，構建體外細胞模型，并沉默細胞STAT3的表達，檢測動物模型和細胞模型中相關炎性因子的表達水平，探討STAT3/iNOS通路在COPD伴氣道重塑中的作用，以期為COPD伴氣道重塑患者的臨床治療提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 40只無特定病原體級雄性Wistar大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司[許可證號：SCXK(川)2019-028]，體質量200～210 g，6～7周齡，置于溫度為(20±2)℃、濕度為50%～60%、12 h光暗循環的環境中喂養，自由飲水、進食。本研究動物實驗的開展符合國家實驗室動物倫理保護標準及相關法律規定，按照3R原則給予實驗動物人道的關懷照顧。

1.2 實驗細胞、主要試劑和儀器 大鼠支氣管上皮細胞購自ATCC細胞庫。STAT3特異性抑制劑Stattic(Medchem Express公司；規格：100 mg；批號：M00248)，醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H33020822)，紅塔山牌香煙(焦油含量11 mg/支、一氧化碳含量11 mg/支、煙堿含量1.1 mg/支；紅塔集團玉溪卷煙廠，批號：210104)，RNA小干擾陰性對照載體質粒(si-NC)及RNA干擾STAT3載體質粒(si-STAT3)由生工生物工程(上海)股份有限公司構建，瑞氏-姬姆薩染色試劑盒(北京西華儀器科技有限公司，批號：M382537)，大鼠分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)、分泌成分(secretory component，SC)、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)ELISA試劑盒(上海潤裕生物科技有限公司，批號：ry010580、ry063287、ry064258、ry076305)；十二烷基硫酸鈉、脂多糖、Lipofectamine 2000轉染試劑盒、反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(美國Sigma Aldrich Lab & Production Materials公司，批號：L3771、SMB00704、NPT01、11483188001、QR0100)，RNA提取試劑盒、蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司，批號：RCH003、ZLI-9018、36208ES60、K-PRTD2FS)，4%多聚甲醛(武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：G1101)，胎牛血清、DMEM和HE染色試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號：E510002、E600008、E607318]，STAT3、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3，p-STAT3)、iNOS、GAPDH兔單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(Abcam公司，批號：ab32500、ab76315、ab178945、ab181602、ab133470)。尼康SMZ745光學顯微鏡(上海普赫生物科技有限公司)，FLUOstar Omega型全自動多功能酶標儀(BMG LABTECH公司)，全能型凝膠成像分析系統ChemiDoc-MP(山東三瑞科技有限公司)，石蠟切片機(湖北惠達儀器有限公司)，自制熏煙箱(規格：50 cm×50 cm×50 cm)，SNH-Ⅲ型真空抽氣泵(上海將來實驗設備有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 COPD大鼠模型的構建與分組：將40只大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組、STAT3抑制劑組、陽性對照組，每組10只。除對照組外，其余各組大鼠采用氣管滴注脂多糖加煙熏法[8]構建COPD大鼠模型。在實驗的第1天和第15天，向各組大鼠氣管內注入濃度為1 g/mL的脂多糖溶液0.2 mL；在實驗的第2～14天和第16～28天在煙熏箱中點燃12支香煙(燃燒30 min)，使煙熏箱內的煙霧濃度達到實驗要求，然后將各組大鼠放入自制煙熏箱中，30 min/次，2次/d，兩次需間隔2 h。從實驗的第29天開始，給予STAT3抑制劑組大鼠尾靜脈注射500 μg/kg的STAT3特異性抑制劑Stattic[9]，每7 d注射1次；給予陽性對照組大鼠按10 mL/kg灌胃醋酸地塞米松溶液(稱取10.7 μg醋酸地塞米松片，使用10 mL生理鹽水溶解)[10]，1次/d；對照組和模型組按10 mL/kg灌胃生理鹽水，1次/d。4組連續干預28 d。

1.3.2 支氣管上皮細胞的培養與分組：(1)參照陳翠芬等[11]的方法制備香煙煙霧提取物。使用真空抽氣泵將燃燒的20支香煙煙霧吸到含DMEM的細胞培養瓶中，劇烈晃動培養瓶，使煙霧充分溶解，呈咖啡樣色；用氫氧化鈉將含有煙霧的溶液的pH值調整為7.4左右，再用0.45 μm過濾器(杭州凱英儀器經營部，型號：13 mm×0.45 μm)過濾煙霧溶液，所得溶液即為香煙煙霧提取物原液，使用DMEM將香煙煙霧提取物原液稀釋至所需濃度待用。(2)使用含10% 胎牛血清的DMEM培養大鼠支氣管上皮細胞，并將細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中進行傳代培養，細胞融合度達75%時，將細胞密度調整為1×106個/mL，接種至6孔板中，2 mL/孔，然后將細胞隨機為正常組、模型組、si-NC組、si-STAT3組，每組設置6個復孔，使用Lipofectamine 2000試劑盒將載體質粒si-NC轉染si-NC組細胞、載體質粒si-STAT3轉染si-STAT3組，模型組和正常組細胞不給予干預。轉染24 h后，根據相關文獻[11]及前期預實驗結果，使用含3.0%香煙煙霧提取物的DMEM培養模型組、si-NC組和si-STAT3組的細胞，使用DMEM培養正常組細胞，各組均置于37 ℃、5% CO2的培養箱中繼續培養48 h后，收集細胞用于后續實驗。

1.4 觀察指標

1.4.1 計數大鼠肺泡灌洗液中白細胞數量及其他分類細胞比例：末次給藥結束后，即刻通過腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉4組大鼠，開胸分離大鼠氣管、支氣管、肺組織，結扎主支氣管，于4 ℃條件下，用連接注射器的灌洗器通過左、右側支氣管分別向左、右側肺葉中注入2 mL生理鹽水，緩慢抽吸3次，負壓吸出，收集各組大鼠肺泡灌洗液，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，收集沉淀，使用200 μL PBS溶液重懸，制成20 μL懸液。參照黃莉容等[12]的方法，首先在光學顯微鏡下進行白細胞計數，然后使用瑞氏-姬姆薩染色試劑盒對樣本進行染色，進行細胞分類計數，在光學顯微鏡下統計200個細胞中其他分類細胞所占比例，其他分類細胞包括單核巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。其中，單核巨噬細胞的細胞質染成灰藍色，細胞核呈馬蹄形并染成紫藍色；淋巴細胞呈圓形，細胞核致密并染成深紫色；中性粒細胞的細胞核呈分葉狀并染成紫藍色，細胞質幾乎無色；嗜酸性粒細胞體積略大，細胞核呈紫色，細胞質呈紅色。

1.4.2 觀察大鼠肺組織病理學變化：灌洗結束后，對大鼠實施安樂死，取出大鼠肺組織，將右肺迅速置于-80 ℃冰箱用于后續實驗，將左肺迅速置于4%多聚甲醛中固定。取固定24 h后的左肺組織行石蠟包埋，使用切片機制成厚度為4 μm的切片，然后嚴格按照HE染色試劑盒說明書，依次進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蘇木素染色、分化液分化、伊紅染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固等操作，將封固后的切片在室溫下晾干，于光學顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.4.3 測量大鼠支氣管管壁面積及支氣管平滑肌厚度：取1.4.2中各組大鼠肺組織切片，于400倍光學顯微鏡下，挑選出有完整橫斷面的中小支氣管，采用Image J軟件測定支氣管平滑肌面積、支氣管管腔內周長、支氣管壁面積，計算支氣管平滑肌厚度，支氣管平滑肌厚度=支氣管平滑肌面積/支氣管管腔內周長。

1.4.4 檢測大鼠肺組織中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量：取1.4.2中置于-80 ℃冰箱的大鼠部分肺組織，嚴格按照 ELISA試劑盒說明書，使用全自動多功能酶標儀檢測肺組織中的SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量。

1.4.5 檢測大鼠肺組織中STAT3和iNOS蛋白表達水平：取1.4.2中置于-80 ℃冰箱的剩余肺組織，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，采用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，將蛋白煮沸后進行SDS-PAGE，再將蛋白轉至PVDF膜，采用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h，PBS洗膜4次，10 min/次，然后加入稀釋后的p-STAT3(稀釋比為1 ∶2 000)、STAT3(稀釋比為1 ∶2 000)、iNOS(稀釋比為1 ∶2 000)和GAPDH兔單克隆抗體(稀釋比為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，PBS洗膜4次，10 min/次，使用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(稀釋比為1 ∶5 000)室溫孵育PVDF膜2 h，PBS洗膜4次，10 min/次，用ECL顯色試劑盒顯色。以GAPDH為內參，采用全能型凝膠成像分析系統分析目的蛋白的相對表達水平。

1.4.6 檢測各組細胞的白細胞介素1β、腫瘤壞死因子α、STAT3、iNOS mRNA表達水平：使用RNA提取試劑盒提取各組細胞的總RNA，使用分光光度計檢測RNA濃度，用無RNA酶的雙蒸水定量RNA后使用反轉錄試劑盒將RNA合成cDNA。以cDNA為模板，按照說明書配置PCR的反應體系，包括2×SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 10 μL、cDNA模板1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL，共20 μL。設置反應程序為95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 10 s，循環40次。以GAPDH為內參，根據2-ΔΔCt法，計算各組細胞白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、STAT3、iNOS mRNA的相對表達水平。各引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey′s檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組大鼠肺泡灌洗液中白細胞計數及其他分類細胞比例 與對照組相比，模型組大鼠肺泡灌洗液中白細胞計數及淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞比例均升高，而單核巨噬細胞比例降低(均P<0.05)；與模型組相比，STAT3抑制劑組和陽性對照組大鼠肺泡灌洗液中白細胞計數及淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞比例均降低，而單核巨噬細胞比例升高(均P<0.05)；STAT3抑制劑組和陽性對照組大鼠肺泡灌洗液中白細胞計數及其他分類細胞比例差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠肺泡灌洗液中白細胞計數及其他分類細胞比例的比較(x±s)

2.2 4組大鼠肺組織的病理學變化 對照組大鼠的肺組織結構正常，上皮結構完整，無明顯炎性細胞浸潤；模型組大鼠的肺組織出現大量炎性細胞浸潤，肺泡結構紊亂，上皮細胞脫落，肺泡腔不規則擴張；STAT3抑制劑組與陽性對照組大鼠的肺組織炎性細胞浸潤明顯減少，上皮細胞脫落有所改善，肺泡腔較為規則，兩組肺組織病理學變化差異不明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠的肺組織病理學改變(HE染色，×200)

2.3 4組大鼠支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度的比較 與對照組相比，模型組大鼠支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度均增加(均P<0.05)；與模型組相比，STAT3抑制劑組和陽性對照組大鼠支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度均減小(均P<0.05)；STAT3抑制劑組和陽性對照組大鼠支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 4組大鼠支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度的比較(x±s)

2.4 4組大鼠肺組織中的SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量的比較 與對照組相比，模型組大鼠肺組織中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量均升高(均P<0.05)；與模型組相比，STAT3抑制劑組和陽性對照組大鼠肺組織中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量均降低(均P<0.05)；STAT3抑制劑組和陽性對照組大鼠肺組織中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表4。

表4 4組大鼠肺組織中SIgA、SC、TGF-β1和VEGF含量的比較(x±s)

2.5 4組大鼠肺組織中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表達水平的比較 與對照組相比，模型組大鼠肺組織中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表達水平均升高(均P<0.05)；與模型組相比，STAT3抑制劑組和陽性對照組大鼠肺組織中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表達水平均降低(均P<0.05)；STAT3抑制劑組和陽性對照組大鼠肺組織中STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白表達水平差異均無統計學意義(均P>0.05)。見圖2和表5。

表5 4組大鼠肺組織中的STAT3磷酸化水平和iNOS蛋白相對表達水平比較(x±s)

圖2 4組大鼠肺組織中STAT3、p-STAT3、iNOS蛋白表達的Western blot圖

2.6 4組細胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表達水平的比較 與正常組比較，模型組和si-NC組大鼠支氣管上皮細胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表達水平均升高(均P<0.05)；與模型組和si-NC組比較，si-STAT3組大鼠支氣管上皮細胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表達水平均降低(均P<0.05)。見表6。

表6 4組細胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

隨著霧霾等環境污染問題日益嚴重，COPD的患病率和病死率居高不下，對公眾健康造成嚴重威脅，全球每年約有300萬人死于COPD，而在中國COPD的總病死率位居第三位[13]。因此，預防和治療COPD尤為重要。COPD是一種慢性炎癥性疾病，主要影響氣道及肺臟，可引發多種并發癥，包括心血管疾病、肺癌、骨質疏松、焦慮癥等[14]。氣道重塑是COPD持續發展的關鍵因素，其病理基礎包括上皮細胞損傷、炎性因子浸潤、支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度增加等。Vasilescu等[15]發現，COPD患者的支氣管壁面積和支氣管厚度顯著增加，發生氣道重塑，而長期氣道重塑可進一步導致支氣管哮喘等其他肺部并發癥的發生。本研究通過使用氣管滴注脂多糖加煙熏法構建COPD大鼠模型，發現大鼠肺組織出現大量炎性細胞浸潤，肺泡結構紊亂，上皮組織脫落，肺泡腔不規則擴張，支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度均增加，這提示COPD大鼠模型構建成功，且大鼠已發生氣道重塑。

COPD的炎癥反應主要涉及中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞[16]，同時，氣道上皮細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞也參與這一過程，而炎癥反應的關鍵環節是中性粒細胞的激活及聚集，且伴隨SIgA、SC、TGF-β1含量的升高[17]。其中，TGF-β1是氣道炎癥發展成氣道重塑的關鍵因子；SIgA可作為呼吸道疾病的評估指標，當病原體侵入和氣道炎癥發生時，其含量持續升高[18]；而SC與其配體IgA結合后形成SIgA；VEGF水平升高，可使氣道壁增厚，進而引起COPD的發生[5]。此外，有研究表明，STAT3/iNOS信號通路參與細胞氧化應激和炎癥反應[19]。本研究結果顯示，COPD伴氣道重塑大鼠肺泡灌洗液中的白細胞計數及淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞比例增加，而單核巨噬細胞比例降低，且肺組織中的SIgA、SC、TGF-β1、VEGF含量，以及STAT3磷酸化水平、iNOS蛋白表達水平均升高(均P<0.05)。這提示COPD伴氣道重塑大鼠的肺組織出現炎癥反應，同時STAT3/iNOS信號通路處于激活狀態。

有學者發現，運動能夠抑制煙霧誘發的氣道上皮細胞和支氣管周圍白細胞數量增加及磷酸化STAT3表達上調[20]；甘草、苦參、椴素草本聯合治療能夠通過影響COPD小鼠模型中STAT3信號通路，抑制中性粒細胞引起的肺部炎癥，降低肺部炎性細胞浸潤及iNOS表達水平，從而發揮治療氣管炎癥性疾病的作用[21-22]。以上研究表明，抑制STAT3或iNOS的表達，有助于控制呼吸系統炎癥，結合COPD伴氣道重塑時STAT3/iNOS信號通路處于激活狀態的這一結果，我們推測抑制STAT3/iNOS信號通路的表達或可緩解COPD伴氣道重塑的相關表現。本研究采用STAT3特異性抑制劑Stattic干預COPD伴氣道重塑大鼠，結果顯示Stattic干預可改善COPD伴氣道重塑大鼠的肺組織病理學變化，降低其肺泡灌洗液中白細胞計數及淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞比例，并提高單核巨噬細胞比例，減小支氣管壁面積及支氣管平滑肌厚度，下調肺組織中SIgA、SC、TGF-β1、VEGF含量，STAT3磷酸化水平，以及iNOS蛋白表達水平，這提示抑制STAT3/iNOS信號通路的活性可降低COPD大鼠肺組織的炎癥反應，并改善其氣道重塑。

為進一步觀察STAT3/iNOS信號通路在香煙煙霧誘導的COPD伴氣道重塑中的作用，本研究采用干擾技術沉默大鼠支氣管上皮細胞STAT3的表達，結果顯示，經3.0% 香煙煙霧提取物誘導后，大鼠支氣管上皮細胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表達水平均升高(均P<0.05)，這提示香煙煙霧可誘導大鼠支氣管上皮細胞產生炎癥反應，且STAT3/iNOS信號通路可能處于激活狀態；而沉默STAT3表達后，大鼠支氣管上皮細胞中IL-1β、TNF-α、STAT3、iNOS mRNA表達水平均降低(均P<0.05)。結合動物實驗與細胞實驗的結果，我們認為STAT3/iNOS信號通路可能參與香煙煙霧誘導的COPD伴氣道重塑及炎癥反應，而抑制STAT3/iNOS信號通路的活性可以減輕COPD伴氣道重塑大鼠肺組織的炎癥反應，改善氣道重塑。

綜上所述，在香煙煙霧誘導的COPD伴氣道重塑中STAT3/iNOS信號通路處于激活狀態，而抑制該通路的激活可減輕肺組織和支氣管上皮細胞的炎癥反應，改善氣道重塑，這或可為COPD伴氣道重塑的治療提供新的靶點。但是STAT3/iNOS信號通路在COPD伴氣道重塑中的作用機制較為復雜，尚需進一步研究。