Raf-1蛋白激酶及VEGF在大腸腺癌中的表達及臨床意義研究

陳婷，仲麗娟，高鳳婷

1.江蘇省東臺市人民醫院病理科，江蘇東臺 224200；2.江蘇省東臺市人民醫院內分泌科，江蘇東臺 224200；3.江蘇省南京市浦口區中心醫院病理科，江蘇南京 211800

大腸腺癌為臨床常見惡性腫瘤，隨我國飲食習慣、生活方式改變，腸道黏膜刺激性增加，大腸腺癌發生率逐漸增加，主要表現為腹痛、腹脹、便血等癥狀，隨病癥進展，逐漸出現消瘦、體質量迅速下降、乏力、腹部包塊等癥狀，威脅其生命安全，需盡早診斷治療[1-2]。Raf-1蛋白激酶，為Raf基因編碼的蛋白產物，具絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，具促進細胞增殖轉化、細胞程序性死亡等作用，其水平升高可能會增加組織癌變風險[3]。血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具促進血管新生重要因子，其水平升高可刺激局部血管數量增加，為局部組織增殖提供血運支持，而惡性腫瘤組織生長速度快，VEGF水平相應增加，考慮可將其應用至惡性腫瘤診斷中[4]。但目前為止，在大腸腺癌患者臨床診斷中，應用Raf-1、VEGF診斷相關研究較少。為此，本次研究選取江蘇省東臺市人民醫院2021年1—12月期間收治的60例大腸腺癌患者為研究對象，探究上述兩種指標對其診斷價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院60例大腸腺癌患者為研究對象，男32例、女28例，年齡46~76歲，平均（62.10±4.27）歲；體質指數（body mass index,BMI）18~32 kg/m2，平均（25.41±3.02）kg/m2；分化程度：低分化21例、中高度分化39例；有淋巴結轉移24例、無淋巴結轉移36例；浸潤深度：未突破漿膜層23例、突破漿膜層37例；Dukes分期：A期6例、B期19例、C期24例、D期11例。研究經過醫學倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①均經病理組織診斷確診；②年齡≥18歲；③無精神系統疾病，可配合完成研究；④患者對研究知情同意。

排除標準：①病理組織不滿足免疫組化法檢驗者；②術前接受化療或放療治療者；③局部手術治療史者；④手術治療不耐受者。

1.3 方法

儀器及設備：顯微鏡及成像系統（日本OLYMPUS，CX40）；自 動 切 片 機（德 國 Leical，RM2245）；鼠抗人VEGF單克隆抗體（購自福州邁新生物技術）；鼠抗人Raf-1單克隆抗體（購自LAB VISION）。

方法：樣本采用10%福爾馬林固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，連續切片（厚度為4 μm），蘇木素-伊紅染色，置于載玻片（涂有多聚賴氨酸），烤片（60℃，2 h）；二甲苯脫蠟、酒精梯度脫水；緩沖液浸泡（0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液，pH 6.0），加熱至100℃后保溫10 min后自然冷卻；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)沖洗，3次/min，共沖洗2次，甩去多余液體，滴加50 μL3%內源性過氧化氫阻斷劑，孵育（室溫，10 min），甩去多余液體，加一抗，過夜（4℃）；PBS沖洗，5 min/次，共沖洗3次；甩去多余液體，滴加二抗，室溫孵育（30 min），PBS沖洗，3 min/次，共沖洗3次；甩去多余液體，滴加20 μL鏈霉素抗生物素過氧化物酶溶液；去掉PBS溶液，滴加100 μLDAB顯色液完成顯色反應，后以蒸餾水沖洗，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化后，PBS沖洗；酒精梯度干燥脫水，二甲苯透明，樹膠封片后鏡下觀察。

1.4 觀察指標

（1）比較兩種指標在大腸腺癌中的陽性檢出率。①Raf-1蛋白激酶陽性檢出標準：顯微鏡下見細胞核出現棕黃色顆粒[5]；②VEGF陽性檢出標準：細胞膜或胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性[6]；以PBS一抗為陰性對照；400倍鏡下隨機選擇切片內5個視野，每個視野內細胞數量200個，共計1 000個細胞；陰性標準為陽性細胞數量≤10%，陽性標準為陽性細胞數量>10%；③聯合檢測陽性標準：任意一種指標為陽性，即為聯合檢查陽性。（2）比較不同特征（腫瘤直徑、不同分化程度、是否有淋巴結轉移、浸潤深度、Dukes分期）下Raf-1蛋白激酶、VEGF陽性檢出率。

1.5 統計方法

采用SPSS 24.0統計學軟件處理數據，計數資料用[n(%)]表示，進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種指標在大腸腺癌中陽性檢出率

Raf-1蛋白激酶聯合VEGF對病灶陽性檢出率為60.00%，較其單獨診斷高（28.33%、41.67%），差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 兩種指標在大腸腺癌中陽性檢出率

2.2 兩種指標在不同特征大腸腺癌中陽性檢出率

VEGF在有淋巴結轉移、浸潤深度突破漿膜層、Dukes分期為C期+D期中陽性檢出率分別為62.50%、54.05%、54.29%，較無淋巴結轉移、浸潤深度未突破漿膜、Dukes分期為A期+B期27.78%、21.74%、24.00%高，差異有統計學意義（P<0.05）；VEGF在不同腫瘤直徑、腫瘤分化程度中陽性檢出率比較，差異無統計學意義（P>0.05）；Raf-1蛋白激酶在不同腫瘤直徑、分化程度、有無淋巴結轉移、浸潤深度、Dukes分期中陽性檢出率比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

表2 兩種指標在不同特征大腸腺癌中陽性檢出率 [n(%)]

3 討論

Raf蛋白激酶，由raf基因編碼完成，其中Raf-1蛋白激酶廣泛存在于終末分化組織[7-8]。在大腸癌發生過程中，Raf-1蛋白激酶表達增高，可使MAPKs通路被激活，抑制大腸癌組織中Colo-205、SW480細胞中P27KIP1、P21WAF1等抑癌基因表達，加速細胞周期，使癌基因、未能修復完成的受損基因大量聚集、合成，刺激腸黏膜細胞異常增生，最終刺激大腸腺癌產生[9-10]。

VEGF主要功能為刺激血管生成，在對腫瘤影響中，VEGF會直接作用在血管內皮細胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受體，增加血管通透性，使血漿纖維素向外滲出，為血管新生提供細胞遷移途徑，在為腫瘤組織提供血運同時，為腫瘤細胞轉移提供網絡通道[11-12]。

本次研究中，對大腸腺癌組織的Raf-1蛋白激酶、VEGF陽性檢出率進行比較，結果顯示，兩種指標聯合檢查后陽性檢出率較單獨檢查高，而腫瘤不同特征陽性檢出率比較顯示，Raf-1蛋白激酶在不同腫瘤特征檢出率中差異無統計學意義（P>0.05），提示Raf-1蛋白激酶只參與腫瘤發生過程，但對其發展過程無明顯影響；而VEGF在有無淋巴結轉移、浸潤深度、Dukes分期中陽性檢出率差異有統計學意義（P<0.05），即腫瘤進展會出現VEGF陽性檢出率增加的情況[13-14]。兩種指標聯合診斷后，可綜合腫瘤發生、發展過程進行其陽性檢出率評估，可互相彌補不足，進而可提升聯合診斷陽性檢出率。胡伊豆等[15]在對大腸癌患者研究中，以免疫組化法檢測其VEGF陽性情況，發現72例大腸癌患者中，VEGF陽性檢出率為61.11%，較本次41.67%稍高，考慮原因可能與樣本選擇存在差異性有關，淋巴結轉移、侵襲深度達到漿膜外、腫瘤>5 cm時，VEGF陽性檢出率顯著提升（66.67% vs 47.62%，70.59% vs 38.10%，70.97% vs 53.66%），提示VEGF陽性檢出率與腫瘤發展有關，與本次研究觀點一致。但該研究未給出Raf-1蛋白激酶檢出率情況，且未對多種免疫組化指標進行聯合診斷研究，僅研究不同指標在腫瘤組織中陽性檢出率，因此本次研究結果更具優勢，可為大腸癌診斷、預后評估提供更準確參考依據。

綜上所述，大腸腺癌患者VEGF陽性檢出率提升，提示存在淋巴結轉移、浸潤深度增加、Dukes分期增加，可用于診斷及預后評估，且兩種指標聯合應用可提升陽性檢出率。