基于mTOR/p70S6K信號通路探究紫丁香苷對高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞MPC5損傷的影響

姚春紅， 李國紅， 周 波， 徐 佳

(湖北省武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院綜合醫(yī)療科， 湖北 武漢 430040)

糖尿病腎病(diabetes nephropathy，DN)是糖尿病的主要微血管病，是導(dǎo)致腎臟疾病終末期的重要誘因之一；DN在中國的患病率僅次于糖尿病性心血管疾病。DN被認(rèn)為主要與代謝紊亂、血液動力學(xué)紊亂、氧化應(yīng)激損傷、炎癥和遺傳因素有關(guān)。最近，大量研究表明，DN發(fā)病機(jī)理與足細(xì)胞損傷密切相關(guān)，足細(xì)胞參與腎小球?yàn)V過屏障[1]。紫丁香苷是一種苯丙醇苷類化合物，具有增強(qiáng)免疫力、降糖降脂、保肝、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[2]。有研究顯示，紫丁香苷可抑制腦缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應(yīng)，保護(hù)其神經(jīng)功能，對缺血性中風(fēng)具有治療作用[3]。研究表明，足細(xì)胞的損傷和喪失通常是由哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)激活引起的，這可能導(dǎo)致腎小球疾病的進(jìn)展[4]。p70核糖體蛋白S6激酶(p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K)作為mTOR下游信號因子，可與mTOR共同作用影響多種疾病的進(jìn)展[5]。牛曉靜等[6]研究顯示，mTOR/p70S6K信號通路可調(diào)控DN大鼠足細(xì)胞自噬，從而修復(fù)足細(xì)胞損傷。但紫丁香苷是否可通過mTOR/p70S6K信號通路影響足細(xì)胞損傷介導(dǎo)的DN尚未有研究報(bào)道?；诖吮狙芯繑M探究紫丁香苷對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷及mTOR/p70S6K信號通路的影響，為DN的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1細(xì)胞:小鼠足細(xì)胞MPC5購自北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司，批號SJ19102。

1.1.2藥物及試劑:紫丁香苷(純度≥98%，原料藥，貨號134-19-7)購自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；重組小鼠干擾素-γ(IFN-γ)試劑(貨號JN0913L)、化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號JN1514L)購自廣州威佳科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號CK6017-5)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑(貨號CK7193-3)、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC)(貨號CK1923-7)、TRIzol試劑(貨號CK2635-1)、RIPA裂解緩沖液(貨號CK3617-9)、兔抗鼠二抗(貨號CP5319-5)均購自北京百靈威科技有限公司；鬼筆環(huán)肽染色試劑(貨號JT91347)、熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(貨號JT10091)、鼠源mTOR(貨號JT11352)、p70S6K(貨號JT11573)、GAPDH(貨號JT10014)一抗均購自鄭州金圖生物科技有限公司。

1.1.3儀器:酶標(biāo)儀(型號DR3700)、流式細(xì)胞儀(型號iQue 3)、qRT-PCR儀(型號Q2000C)均購自上海然哲儀器設(shè)備有限公司；共聚焦顯微鏡(型號RCM200)、凝膠成像儀(型號CL750)均購自北京森西賽智科技有限公司。

1.2方 法

1.2.1MPC5細(xì)胞培養(yǎng)及分組給藥:將MPC5細(xì)胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素，以及10U/mL重組小鼠IFN-γ。當(dāng)MPC5細(xì)胞生長到70%～80%融合時(shí)，將它們轉(zhuǎn)移至無IFN-γ的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)分化2周。然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。依據(jù)文獻(xiàn)[7,8]進(jìn)行濃度設(shè)置，將MPC5細(xì)胞分為：對照組(5.5mmoL/L葡萄糖)[7]、高糖誘導(dǎo)組(30mmoL/L葡萄糖)[7]、紫丁香苷低濃度組(2.5μmoL/L紫丁香苷+30mmoL/L葡萄糖)、紫丁香苷中濃度組(5μmoL/L紫丁香苷+30mmoL/L葡萄糖)、紫丁香苷高濃度組[8](10μmoL/L紫丁香苷+30mmoL/L葡萄糖)。各組向RPMI 1640培養(yǎng)基中加入上述濃度的相應(yīng)試劑或藥物，培養(yǎng)72h。每組設(shè)置8個(gè)重復(fù)。

1.2.2MPC5細(xì)胞增殖能力測定:收集1.2.1中給藥結(jié)束后的各組MPC5細(xì)胞，將細(xì)胞接種到96孔板中(2000個(gè)/孔)，然后將20μL MTT(5mg/mL)添加到每個(gè)孔中，4h后，棄去上清液，加入150μL二甲基亞砜，振蕩細(xì)胞懸液，并使用酶標(biāo)儀測量480 nm波長處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力(細(xì)胞活力=各處理組吸光度值/對照組吸光度值×100%)。

1.2.3MPC5細(xì)胞凋亡能力測定:收集1.2.1中給藥結(jié)束后的各組MPC5細(xì)胞，將細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度重懸于800μL結(jié)合緩沖液中，加入10μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶，在黑暗中于25℃孵育25min，然后采用流式細(xì)胞儀分析MPC5細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4MPC5細(xì)胞骨架形態(tài)觀察:收集1.2.1中給藥結(jié)束后的各組MPC5細(xì)胞，多聚甲醛固定細(xì)胞25min，PBS清洗，然后添加鬼筆環(huán)肽染色試劑(紅光)150μL，避光染色60min，置于共聚焦顯微鏡下觀察MPC5細(xì)胞骨架形態(tài)。

1.2.5MPC5細(xì)胞mTOR、p70S6K信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)測定:收集1.2.1中給藥結(jié)束后的各組MPC5細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取MPC5細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。熱循環(huán)條件如下：在93℃下初始變性57s；然后39個(gè)循環(huán)(93℃變性，16s、57℃退火，22s、71℃延伸，13s)。使用2-ΔΔCt法定量mTOR、p70S6K mRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。引物序列如下：mTOR正向5'-GAGACCGAGTCGCTCAAGTCCTA-3'和反向5'-AGTCGGGATGTCTGCTGGTA-3'；p70S6K正向5'-GTACGTCGATCGATCGTAGCTCGATCGATGAGAGTC-3'和反向5'-CACTAGAGAGCTGCATGTAGCTAGCTGCTAGCTCGAT-3'；GAPDH正向5'-ACCTGACCTGCCGTAGAA-3'和反向5'-TCCACCCTGTTGCTGTA-3'。GAPDH被用作內(nèi)部參考，北京密碼子生物科技有限公司負(fù)責(zé)引物的設(shè)計(jì)合成。

1.2.6MPC5細(xì)胞mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)測定:收集1.2.1中給藥結(jié)束后的各組MPC5細(xì)胞，PBS洗滌兩次，將細(xì)胞在RIPA裂解緩沖液中裂解分離蛋白質(zhì)，定量蛋白濃度后，取100μg的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶封閉后，添加鼠源mTOR(1∶380)、p70S6K(1∶380)、GAPDH(1∶480)一抗于4℃孵育12h，添加兔抗鼠二抗(1∶1700)于25℃孵育1.5h，化學(xué)發(fā)光試劑盒對蛋白條帶進(jìn)行顯色，ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1紫丁香苷對MPC5細(xì)胞增殖能力的影響:與對照組比較，高糖誘導(dǎo)組MPC5細(xì)胞吸光度值、細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；與高糖誘導(dǎo)組比較，紫丁香苷低、中、高濃度組MPC5細(xì)胞吸光度值、細(xì)胞活力依次升高(P<0.05)。見表1。

表1 紫丁香苷對MPC5細(xì)胞吸光度值和細(xì)胞活力的影響

2.2紫丁香苷對MPC5細(xì)胞凋亡能力的影響:與對照組比較，高糖誘導(dǎo)組MPC5細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與高糖誘導(dǎo)組比較，紫丁香苷低、中、高濃度組MPC5細(xì)胞凋亡率依次降低(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 紫丁香苷對MPC5細(xì)胞凋亡率的影響

圖1 不同濃度紫丁香苷對MPC5細(xì)胞凋亡率的影響

2.3紫丁香苷對MPC5細(xì)胞骨架形態(tài)的影響:對照組MPC5細(xì)胞骨架形態(tài)正常，細(xì)胞長軸呈線性分布，熒光染色明顯；高糖誘導(dǎo)組MPC5細(xì)胞骨架斷裂，細(xì)胞萎縮，熒光染色黯淡；紫丁香苷低、中、高濃度組MPC5細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)恢復(fù)清晰，熒光強(qiáng)度逐漸變亮，足突趨于明顯；見圖2。

圖2 不同濃度紫丁香苷對MPC5細(xì)胞骨架形態(tài)的影響(鬼筆環(huán)肽染色，×400)

2.4紫丁香苷對MPC5細(xì)胞mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)水平的影響:與對照組比較，高糖誘導(dǎo)組MPC5細(xì)胞mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；高糖誘導(dǎo)組比較，紫丁香苷低、中、高濃度組MPC5細(xì)胞mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)水平依次降低(P<0.05)。見表3。

表3 紫丁香苷對MPC5細(xì)胞mTOR p70S6K mRNA表達(dá)水平的影響

2.5紫丁香苷對MPC5細(xì)胞mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)水平的影響:與對照組比較，高糖誘導(dǎo)組MPC5細(xì)胞mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；高糖誘導(dǎo)組比較，紫丁香苷低、中、高濃度組MPC5細(xì)胞mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)水平依次降低(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 紫丁香苷對MPC5細(xì)胞mTOR p70S6K蛋白表達(dá)水平的影響

圖3 各組MPC5細(xì)胞mTOR、p70S6K蛋白印跡圖注：A：對照組；B：高糖誘導(dǎo)組；C：紫丁香苷低濃度組；D：紫丁香苷中濃度組；E：紫丁香苷高濃度組

3 討 論

足細(xì)胞是高度分化的上皮細(xì)胞，是腎小球?yàn)V過屏障功能的基本組成部分。足細(xì)胞損傷和凋亡是大量蛋白尿和腎小球硬化的原因，已成為DN的中心因素。因此，探索足細(xì)胞凋亡和損傷的機(jī)制將為DN的治療提供重要的方法。研究發(fā)現(xiàn)，DN中足細(xì)胞的增殖和再生是有限的，其異常凋亡與DN的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)組MPC5細(xì)胞骨架斷裂，細(xì)胞萎縮，熒光染色黯淡，吸光度值、細(xì)胞活力顯著降低，凋亡率顯著增高，與Han等[10]的研究一致，表明高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型建立成功。紫丁香苷具有多種藥理作用，研究顯示，紫丁香苷不僅能夠抑制乳腺癌進(jìn)展，還能改善骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織病理損傷[11,12]。此外，紫丁香苷還能通過改善β淀粉樣肽誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的神經(jīng)毒性，恢復(fù)細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞凋亡治療阿爾茨海默病[13]。但目前未有紫丁香苷對足細(xì)胞損傷影響的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)紫丁香苷處理后，高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞損傷減輕，細(xì)胞活力升高，凋亡率降低，且紫丁香苷濃度越高，效果越明顯。提示紫丁香苷可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡進(jìn)而改善高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞損傷。

mTOR/p70S6K信號通路可參與多種生理病理過程，影響細(xì)胞生長、分化、代謝等過程。研究顯示，抑制mTOR/p70S6K信號通路可降低mTOR、p70S6K蛋白表達(dá)，從而抑制Caco-2細(xì)胞凋亡，減輕脂多糖誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞屏障損傷[14]。文獻(xiàn)表明小檗堿能抑制mTOR/p70S6K信號通路激活足細(xì)胞自噬，從而減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞中mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，與Li等[15]的研究結(jié)果一致，提示高糖環(huán)境可導(dǎo)致MPC5細(xì)胞中mTOR/p70S6K信號通路被激活。而高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞經(jīng)紫丁香苷處理后，mTOR、p70S6K mRNA和蛋白表達(dá)降低，且紫丁香苷濃度越高，降低幅度越大，表明紫丁香苷可抑制MPC5細(xì)胞中mTOR/p70S6K信號通路的激活。本研究結(jié)合上述結(jié)果推斷紫丁香苷對高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與其能抑制mTOR/p70S6K信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述，紫丁香苷對高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，能明顯促進(jìn)MPC5細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，其機(jī)制可能與抑制mTOR/p70S6K通路的激活有關(guān)。本研究的不足之處在于未設(shè)置mTOR通路激活劑組，下一步將采用mTOR通路激活劑進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的結(jié)果。