糖基轉移酶UGT73C5在大腸桿菌中的可溶性表達研究

方紅輝，倪曄，周婕妤，董晉軍，許國超，張兆俊，韓瑞枝*

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 3(丹陽市金丹陽酒業有限公司，江蘇 丹陽，212300)

尿苷二磷酸糖基轉移酶(uridine diphosphate glycosyltransferase，UGT)能夠催化糖基配體從活化的核苷酸糖基供體轉移到特定的受體分子上，從而調節受體的特性(如生物活性/溶解度和轉運等)[1-2]。大部分UGT來源于植物或者動物，野生株產量不能滿足工業化要求，因此需要通過微生物異源表達提高UGT的產量。目前限制UGT工業生產的主要因素為異源表達可溶性差，表達量低以及需要昂貴的尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose，UDPG)作為供體[3]。通過與蔗糖合酶(sucrose synthase，SUSy)的偶聯可實現UDPG的循環再生[4-5]，但是可溶性表達差的問題至今仍未有效解決。擬南芥來源的糖基轉移酶UGT73C5可以催化肉桂醇，油菜素類固醇，人參二醇和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等的糖基化，廣泛應用于醫藥和保健食品中[6-9]。但是UGT73C5在大腸桿菌中異源表達大多以無活性的包涵體形式存在，嚴重限制了其工業應用。

一般來說，包涵體形成一般是由于蛋白翻譯過程中表達過快或者缺失一定的后修飾從而導致不正確或不充分的折疊[10]。通過優化誘導條件[如初始細胞密度、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)濃度、誘導時間和誘導溫度]可在一定程度上改善蛋白可溶性表達，但通常效果甚微。分子伴侶共表達與助溶蛋白標簽融合表達是目前研究最多的蛋白可溶性改善方法[11-12]。LASKEY等[13]在非洲爪蟾卵的浸出液中發現了分子伴侶蛋白，如GroES、GroEL、DnaK、DnaJ、GrpE和觸發因子(trigger factor，TF)等，可參與協助生物大分子的折疊、組裝、轉運及降解等過程，從而極大程度提高目的蛋白的可溶性表達。這些分子伴侶對體外模型蛋白的正確折疊、聚集和組裝具有顯著影響[14-16]。例如，伴侶質粒pG-KJE8、pGro7和pG-TF2可以顯著提高TtSPase的可溶性表達[17]，通過與pGro7共表達，4-α-葡糖基轉移酶產量提高了24.6倍[18]。另外，一些高度可溶的蛋白與目的蛋白融合表達時對目的蛋白具有助溶效果，這些蛋白往往被設計為助溶標簽[19]。硫氧還蛋白Trx-tag，是一種分子質量為12 kDa的氧化還原蛋白，可催化還原蛋白質二硫鍵，促進目的蛋白二硫鍵的形成[20]；谷胱甘肽巰基轉移酶標簽蛋白GST-tag是一個大小為26 kDa左右的轉移酶，本身在大腸桿菌中可大量可溶性表達，同時也可以提高共表達的蛋白可溶性。在大多數情況下，該標簽的存在還有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩定性[21]。研究發現融合Trx標簽的人胰島素可溶性表達明顯提高[22]，融合GST后人干擾素蛋白可實現70%的可溶表達[23]。

本研究將UGT73C5在EscherichiacoliBL21(DE3)中進行異源表達，通過與分子伴侶共表達以及與助溶蛋白標簽融合表達等方法提高其可溶性表達，并對不同方法表達效果進行了比較。最后，對融合酶GST-UGT73C5催化2 mmol/L肉桂醇糖基化合成絡塞的反應進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究中用到的質粒和菌株如表1所示。來自擬南芥的UDP糖基轉移酶UGT73C5 (GenBank:NP_181218.1)基因，上海亦欣生物技術有限公司優化合成。載體質粒pET-28a(+)、pET-32b(+)和pET-42b(+)，本實驗室收藏，E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)菌株分別用作質粒構建和目的基因表達的宿主。4種含有分子伴侶基因的質粒pG-KJE8、pGro7、pKJE7和pG-TF2，寶生物工程(大連)有限公司。肉桂醇及絡塞，上海源葉生物有限公司。UDPG，廣東昂飛生物有限公司。

表1 本研究中使用的質粒和菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 重組UGT73C5菌株的構建

將合成的UGT73C5基因克隆至載體pET-28a(+)中的限制性位點BamH I和XhoI之間構建重組質粒pET28a-UGT73C5，并轉化至E.coliBL21(DE3)中構建UGT73C5重組表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-UGT73C5(簡稱BL21-UGT73C5)。

1.2.2 UGT73C5與分子伴侶共表達菌株的構建

將pET28a-UGT73C5質粒分別和pG-KJE8、pGro7、pKJE7和pG-TF2這4種伴侶質粒同時轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞并涂布至含有50 μg/mL卡那霉素和20 μg/mL氯霉素雙抗生素的平板中構建分子伴侶共表達菌株，分別命名為E.coliBL21(DE3)/pG-KJE8/pET28a-UGT73C5(簡稱BL21-KJE8/UGT73C5)、E.coliBL21(DE3)/pGro7/pET28a-UGT73C5(簡稱BL21-RO7/UGT73C5)、E.coliBL21(DE3)/pKJE7/pET28a-UGT73C5(簡稱BL21-KJE7/UGT73C5)和E.coliBL21(DE3)/pG-TF2/pET28a-UGT73C5(簡稱BL21-TF2/UGT73C5)。

1.2.3 Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5融合表達菌株的構建

本研究中所用到的引物見表2。質粒載體pET-32b(+)、pET-42b(+)分別帶有助溶蛋白標簽：硫氧還蛋白標簽(thioredoxin tag， Trx-tag)和谷胱甘肽巰基轉移蛋白標簽(glutathione mercapto transfer protein tag，GST-tag)。通過PCR擴增pET28a-UGT73C5中的目的基因(UGT73C5)，并通過ClonExpress Ⅱ一步克隆試劑盒克隆至載體pET-32b(+)與pET-42b(+)的雙酶切位點BamH I和XhoI之間，構建重組質粒pET32b-UGT73C5和pET42b-UGT73C5。將這些重組質粒轉化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，并分別涂布至帶有100 μg/mL氨芐青霉素和50 μg/mL卡那霉素的LB平板中以構建Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5融合酶表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET32b-UGT73C5(簡稱BL21-Trx-UGT73C5)和E.coliBL21(DE3)/pET42b-UGT73C5(簡稱BL21-GST-UGT73C5)。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.4 重組酶的表達與純化

將不同的重組大腸桿菌表達菌株在含有相應抗生素的40 mL LB培養基中于37 ℃、200 r/min培養至OD600=0.8～0.9時，加入0.2 mmol/L IPTG(分子伴侶共表達菌株需加入0.5～4 mg/mLL-阿拉伯糖和/或1～10 ng/mL四環素)，于16 ℃、200 r/min搖床中誘導20 h。通過離心(8 000 r/min、5 min)收集細胞，將細胞重懸于8 mL PBS緩沖液(pH 7.5)中，并在冰水浴中超聲處理10 min。離心分離上清液與沉淀，并經SDS-PAGE進一步分析。重組酶UGT73C5、Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5通過Ni-NTA親和層析純化。

1.2.5 大腸桿菌細胞光密度與細胞濕重、干重的關系

細胞濕重：收集不同體積的大腸桿菌培養液(10、20、30、40、50、60、70 mL)，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，將離心管倒置于清潔的吸水紙上約數分鐘，擦凈管壁上水漬，隨即稱量，細胞濕重等于稱量的質量減去已預先稱重的離心管質量。將已稱量的濕細胞重懸于20 mL PBS緩沖液中以配制不同質量濃度的細胞溶液，充分混勻，吸取1 mL重懸的溶液稀釋10倍后測定其在600 nm下的吸光度，并繪制細胞濕重與細胞光密度之間的標準曲線。

細胞干重：收集不同體積的大腸桿菌培養液(10、20、30、40、50、60、70 mL)，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，用去離子水洗滌沉淀兩次，凍干備用。稱取不同質量的凍干細胞重懸于20 mL PBS緩沖液中，以配制不同質量濃度的細胞溶液并測定600 nm下的吸光度，并繪制細胞干重與細胞光密度之間的標準曲線。

細胞光密度(OD600)與細胞干重、濕重呈良好線性關系，如圖1所示。

圖1 大腸桿菌細胞光密度(OD600)與細胞干重、 濕重的標準曲線Fig.1 Standard curve between E.coli cell optical density (OD600) and dry/wet weight cells

1.2.6 酶活力分析

高速離心收集40 mL LB培養基中誘導后的菌體細胞并棄盡上清液，重懸于8 mL PBS (100 mmol/L，pH 7.5)緩沖液中，稀釋25倍測定其在600 nm下的吸光度并換算成其細胞干重。超聲破碎后離心獲取上清液，將含有100 mmol/L PBS (pH 7.5)、10 mmol/L肉桂醇、5 mmol/L UDPG和30 μL上清酶液的反應混合液(總體系300 μL)于40 ℃反應10 min，反應結束后加入600 μL甲醇以淬滅反應。反應液經12 000 r/min離心5 min并通過0.22 μm濾膜過濾后，通過HPLC分析反應產物。酶活力單位(U)定義為每分鐘產生1 μmol絡塞所需的酶量，酶活力(U/g細胞)定義為單位質量細胞干重所具有的酶活力。

酶的比活力通過含有100 mmol/L PBS (pH 7.5)、10 mmol/L肉桂醇、5 mmol/L UDPG和0.02 mg/mL純酶的反應混合液(總體系300 μL)在40 ℃反應10 min測定。蛋白濃度采用Bradford法測定，比活力(U/mg 蛋白)指的是單位質量的酶所對應的活力。

1.2.7 融合酶在絡塞合成中的應用

取相同質量的BL21-UGT73C5和BL21-GST-UGT73C5細胞，分別重懸于8 mL PBS (100 mmol/L，pH 7.5)緩沖液中，配制成細胞濃度為15 g/L的懸浮液，破碎離心后獲取上清液。將含有100 mmol/L PBS (pH 7.5)、2 mmol/L肉桂醇、10 mmol/L UDPG和2.5 mL上清液酶液(總體系為5 mL)的混合液于40 ℃反應，在0.5、1、2、4、6、8、10、12 h分別取樣并加入甲醇以淬滅反應。反應液經12 000 r/min離心5 min，并通過0.22 μm濾膜過濾后，通過HPLC分析反應產物。轉化率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Mp表示生成絡塞的物質的量濃度，mmol/L；Ms表示剩余底物肉桂醇的物質的量濃度，mmol/L。

1.2.8 HPLC檢測方法

使用HPLC 1260系統(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)和Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)對底物肉桂醇和糖基化產物絡塞進行定量測定。肉桂醇和絡塞的洗脫條件如下：50%溶劑A(H2O)；50%溶劑B(乙腈)；流速1 mL/min；吸光度254 nm；柱溫30 ℃。

2 結果與分析

2.1 UGT73C5在大腸桿菌中的表達及活力表征

BL21-UGT73C5菌株的表達情況如圖2所示，在破碎沉淀中，大約在56 kDa有一條明顯條帶，與理論UGT73C5的分子質量相近，而上清液中在該位置無明顯條帶。這說明大多數UGT73C5蛋白以不溶性包涵體形式存在。因此，增加UGT73C5可溶性表達是非常必要的。本研究中，通過HPLC檢測UGT73C5對肉桂醇的糖基化活力，并以上清液酶活力表征可溶性蛋白表達量。結果表明，反應產物與絡塞標準品具有相同的保留時間(大約2.5 min)，而在對照樣品中[E.coliBL21(DE3)/pET-28a (+)空載誘導表達]未檢測到新產物的生成(圖3)。通過產物絡塞的標準曲線定量分析，UGT73C5在大腸桿菌中表達的酶活力為18.56 U/g細胞。

圖2 UGT73C5在E.coli BL21(DE3)中異源表達的 SDS-PAGEFig.2 Analysis of SDS-PAGE of UGT73C5 in E.coli BL21(DE3)

圖3 UGT73C5催化肉桂醇糖基化反應的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of cinnamyl alcohol glycosylation by UGT73C5

2.2 分子伴侶共表達提高UGT73C5可溶性表達

為了改善UGT73C5的可溶性表達，研究了UGT73C5與4個伴侶蛋白質粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7和pG-TF2)的共表達情況。如圖4-a所示，SDS-PAGE結果表明4種分子伴侶質粒與UGT73C5共表達成功。如圖4-b所示，UGT73C5的原始酶活力為18.56 U/g細胞，添加分子伴侶蛋白質粒pG-KJE8、pGro7、pKJE7和pG-TF2后的酶活力分別為原始酶活力的1.27、1.18、0.91、1.37倍。其中質粒pG-KJE8、pGro7和pG-TF2中均含有分子伴侶GroES-GroEL、GroEL的內腔可以與變性多肽結合，在輔因子GroES調節的ATP依賴性反應中釋放。GroES和GroEL作為折疊酶與多肽相互作用并幫助正確重新折疊[24]，GroES-GroEL可以作為mRNA穩定劑來增加蛋白質的產生[25]。與pGro7相比，pG-KJE8與UGT73C5共表達后可溶性提高更為明顯(圖4-b)。原因可能是在GroES-GroEL和DnaK-DnaJ-GrpE伴侶蛋白共同輔助下，UGT73C5折疊方面表現更為良好。DnaK還可以穩定蛋白質，以供GroEL進行后續折疊[26]。GroES-GroEL和DnaK-DnaJ-GrpE在大多數蛋白質的折疊和組裝中具有互補功能[27]。與pG-TF2共表達導致更高的可溶性UGT73C5表達，可能是因為觸發因子TF可以識別肽底物中的芳香族和堿性氨基酸殘基，然后與肽結合[28]，進一步避免錯誤折疊，保護新生鏈不被蛋白酶消化，并與其他伴侶合作協助折疊。因此，伴隨TF (pG-TF2)的GroES-GroEL在體內對UGT73C5產生積極影響。

2.3 重組Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5融合蛋白的表達

雖然與分子伴侶共表達后的UGT73C5的可溶性表達有一定程度的改善，但效果并不明顯。本研究進一步通過UGT73C5與Trx-tag (12 kDa)和GST-tag (26 kDa)分別融合表達，結果如圖5-a所示。融合酶Trx-UGT73C5的包涵體含量仍然較高，但上清液中表達量較原始UGT73C5表達情況有明顯提高。融合酶GST-UGT73C5在16 ℃下表達，幾乎沒有包涵體存在，而在上清液中觀察到更多的蛋白表達。為了進一步提高其表達效果，提高誘導表達的溫度至25 ℃，GST-UGT73C5蛋白含量顯著提高，雖然有少部分包涵體出現，但大部分仍以可溶形式存在。如圖5-b所示，融合酶Trx-UGT73C5酶活力為26.95 U/g細胞，是原始酶活力的1.45倍；在25 ℃誘導表達的GST-UGT73C5酶活力達到47.17 U/g細胞，是原始酶活力的2.54倍。為了研究融合標簽蛋白對UGT73C5比酶活力的影響，測定了純化后的GST-UGT73C5和Trx-UGT73C5以及原始酶UGT73C5的比活力。結果如表3所示，Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5比活力分別為0.68、 0.72 U/mg蛋白，是原始酶比活力(0.79 U/mg蛋白)的0.86、0.91倍。以上結果表明助溶蛋白標簽對糖基轉移酶UGT73C5的N端修飾能夠明顯提高其可溶性表達，并且助溶蛋白(尤其是GST)對UGT73C5自身的催化活力沒有顯著影響，無需切割分離。

a-分子伴侶共表達SDS-PAGE分析；b-分子伴侶共表達酶活力分析 [1-BL21-UGT73C5 (16 ℃);2-BL21-KJE8/UGT73C5 (16 ℃)； 3-BL21-RO7/UGT73C5 (16 ℃)；4-BL21-KJE7/UGT73C5 (16 ℃)； 5-BL21-TF2/UGT73C5 (16 ℃)]圖4 UGT73C5與不同分子伴侶共表達后蛋白表達及酶活力分析Fig.4 Analysis of protein expression and activities of UGT73C5 co-expressed with different molecular chaperones

a-融合酶SDS-PAGE；b-融合酶活力分析 [1-BL21-UGT73C5 (16 ℃);2-BL21-Trx-UGT73C5 (16 ℃); 3-BL21-GST-UGT73C5 (16 ℃);4-BL21-GST-UGT73C5 (25 ℃)]圖5 UGT73C5與Trx和GST融合后蛋白表達及酶活力分析Fig.5 Analysis of protein expression and activities of UGT73C5 fused with Trx and GST

表3 融合酶的純酶比活力Table 3 Specific activities of purified fusion enzymes

2.4 融合酶GST-UGT73C5在絡塞合成中的應用

分別將融合酶GST-UGT73C5和原始酶應用于2 mmol/L肉桂醇糖基化合成絡塞的反應。如圖6-a所示，純化后GST-UGT73C5(0.2 mg/mL)在6 h后能夠轉化96.3%的肉桂醇為絡塞，與純化后原始酶(0.2 mg/mL)轉化率一致，說明增加融合標簽GST后，對催化肉桂醇糖基化沒有影響。對相同濃度細胞破碎后的GST-UGT73C5和原始酶粗酶催化反應比較(圖6-b)發現，GST-UGT73C5在4 h內轉化率就達到90.7%，6～12 h維持在93.6%，而原始酶在12 h轉化率才達到88.5%。結果表明單位質量菌體融合酶GST-UGT73C5較原始酶具有更高的表達量，從而導致更高的轉化率。因此，融合酶GST-UGT73C5在酶法合成絡塞的應用中具有更大的潛力。

a-GST-UGT73C5與UGT73C5的純酶反應比較；b-同等濃度 BL21-GST-UGT73C5與BL21-UGT73C5細胞破碎上清液反應比較圖6 GST-UGT73C5與UGT73C5催化肉桂醇糖基化的反應分析Fig.6 Analysis of cinnamyl alcohol glycosylation reaction catalyzed by GST-UGT73C5 and UGT73C5

3 結論

糖基轉移酶UGT73C5可以催化肉桂醇的糖基化合成絡塞，然而異源表達可溶性差限制了其工業應用價值，為提高UGT73C5在大腸桿菌中的可溶性表達，本研究通過分子伴侶共表達和助溶蛋白標簽融合表達的方式改善了UGT73C5可溶性差的問題。3種商業化的分子伴侶蛋白質粒pG-KJE8、pGro7和pG-TF2對UGT73C5的可溶性表達均有一定程度促進作用，其中pG-TF2表達的伴侶蛋白組合GroES-GroEL-Tig效果最好，表達量為原始酶可溶性表達量的1.37倍；融合表達了兩種助溶蛋白標簽硫氧還蛋白Trx-tag和谷胱甘肽巰基轉移蛋白GST-Tag，其中融合蛋白GST-UGT73C5可溶性表達量最高，在25 ℃誘導條件下，為原酶初始表達量的2.54倍。純化后GST-UGT73C5比活力與原酶相比沒有明顯下降，表明該N端修飾對其自身的催化活力沒有顯著影響，無需切割分離。在2 mmol/L肉桂醇催化反應中，同等細胞濃度的GST-UGT73C5粗酶液比原始酶UGT73C5粗酶液具有更高的轉化效率。GST-UGT73C5粗酶催化反應在4 h內催化肉桂醇轉化率達到90%以上，最高可達93.6%，而原始酶在12 h才達到88.5%。因此，融合酶GST-UGT73C5可能成為絡塞酶法合成中更具有應用潛力的酶。