水稻內(nèi)生成團(tuán)泛菌YS19與菠蘿泛菌YJ76共培養(yǎng)提高環(huán)境脅迫生存適應(yīng)性

孫遠(yuǎn)浩, 周心怡, 何新宇, 楊逸軒, 馮永君,2*

(1. 北京理工大學(xué) 生命學(xué)院,北京 100081;2. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室深圳分中心農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)基因數(shù)據(jù)分析重點實驗室 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所,廣東 深圳 518120)

植物內(nèi)生菌是指能定殖在健康植物組織內(nèi)并與植物建立了和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物[1]。它們可以主動侵染定殖在健康植物組織中,大部分菌體的定殖都能使內(nèi)生菌和植物彼此受益[2-3]。成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)是一種重要的環(huán)境微生物,廣泛分布于植物、動物、空氣、土壤、水等各種環(huán)境中[4]。成團(tuán)泛菌YS19是從水稻“越富”品種中分離出的一種優(yōu)勢內(nèi)生菌,其在植株的各個生長階段的各個器官中大量分布[5]。YS19表現(xiàn)出很強(qiáng)的固氮活性,分泌各類植物激素,調(diào)節(jié)光合產(chǎn)物由莖、葉向穗的轉(zhuǎn)移,具有促進(jìn)水稻增產(chǎn)的潛力[6]。前期相關(guān)的研究表明,YS19生長到一定階段或感受逆境時會形成菌體聚集的共質(zhì)體結(jié)構(gòu)[7-8],該結(jié)構(gòu)并非源自細(xì)胞分裂產(chǎn)生的單克隆體系,而是由分散的細(xì)菌細(xì)胞主動聚集形成的[6,9],形成共質(zhì)體可以減弱環(huán)境中逆境因素的侵害[10-12]。 菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)YJ76是從同一水稻品種中分離得到的一種優(yōu)勢內(nèi)生菌,其與YS19合計占到在該宿主分離菌總豐度的90%以上,盡管兩個菌株都非常有優(yōu)勢,但YS19依然占據(jù)了統(tǒng)治性的地位。YJ76同樣能分泌多種植物激素,具有很強(qiáng)的固氮活性,與宿主互作時增加水稻苗的生物量[13]。YJ76能大量產(chǎn)生吲哚信號[14],而吲哚是近年來備受關(guān)注的一種信號分子,被認(rèn)為在細(xì)菌種內(nèi)和種間發(fā)揮重要調(diào)控作用[15]。共質(zhì)體結(jié)構(gòu)最早由Achouak等[16]報道,細(xì)菌聚集形成共質(zhì)體結(jié)構(gòu)后,在抵抗損傷、增強(qiáng)代謝、適應(yīng)環(huán)境等方面,會產(chǎn)生分散細(xì)胞所不具備的一些優(yōu)勢[17]。當(dāng)細(xì)菌處于逆境,如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、抗生素、紫外線、干燥等環(huán)境下,形成共質(zhì)體的菌體能夠表達(dá)特定應(yīng)激蛋白以及啟動新的代謝模式;另外,大量細(xì)菌聚集成團(tuán)受特定的信號分子調(diào)節(jié),具有群體優(yōu)勢,這種優(yōu)勢在菌體定殖、環(huán)境棲息中具有重要意義[18-21]。本研究探索了微生態(tài)菌體棲息環(huán)境下YS19與YJ76的相互作用對共質(zhì)體形成和抗逆作用的影響,相關(guān)研究增加了對植物內(nèi)生菌間互作關(guān)系的認(rèn)識,為開發(fā)新型多菌種協(xié)同的生物菌劑并應(yīng)用到水稻生產(chǎn)實踐提供了可借鑒的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)YS19(NCBI 16S rDNA AB033602)和菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)YJ76(NCBI 全基因組序列號 CP022427)均為北京理工大學(xué)生命學(xué)院植物與微生物相互作用實驗室(本實驗室)從水稻“越富”品種中分離得到的植物內(nèi)生菌。YJ76突變株Δzwf采用Tn5插入突變法篩選獲得,突變基因編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶,經(jīng)測定該基因突變后對菌體的生長沒有實質(zhì)性影響,但吲哚產(chǎn)量相比野生株減少38.59%[22],帶有氨芐青霉素、利福平(Amp,Rp)抗性。大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α,含有pBBR1-MCS-2-GFP質(zhì)粒,能夠表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP),具有卡那霉素(Kan)抗性,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所魏海雷研究員友好提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10,胰蛋白胨 10,酵母浸提物 5,121 ℃滅菌20 min,配制固體培養(yǎng)基時,瓊脂加入量為1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 磷酸緩沖液(PBS,g/L)：NaCl 8.0,KCl 0.2,Na2HPO4·12H2O 2.9,KH2PO40.2;ZnSO4、NaCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、抗生素、番紅等均購自北京索萊寶科技有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自賽默飛世爾科技公司。電子天平(JY1002,上海良平儀器儀表有限公司);恒溫震蕩搖床(TH2-C,蘇州培英實驗設(shè)備有限公司);小型臺式高速離心機(jī)(I-14,德國Sigma公司);光學(xué)顯微鏡(SK-FL,重慶奧特光學(xué)儀器有限公司);激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(CLSM,ZEISS LSM510 META,蔡司集團(tuán))。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將甘油保存的兩種菌株分別于LB固體培養(yǎng)基上劃線,30 ℃倒置培養(yǎng)24 h后,挑取單菌落接種至20 mL LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12 h制備種子液,然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)接到裝有150 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中,培養(yǎng)16 h后備用[12]。本研究中有關(guān)細(xì)菌的實驗,如無特殊說明均以1%(體積分?jǐn)?shù))接種至培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min培養(yǎng)。

1.2.2 YJ76-GFP菌株的構(gòu)建 將含有pBBR1-MCS-2-GFP質(zhì)粒的E.coliDH5α接種至LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h,然后使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒pBBR1-MCS-2-GFP。制備YJ76感受態(tài)細(xì)胞并以質(zhì)粒pBBR1-MCS-2-GFP為材料電擊轉(zhuǎn)化[23],轉(zhuǎn)化完成后涂布于LB平板培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落,挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)獲得能夠表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的YJ76-GFP菌株。

1.2.3 YJ76與YS19的共培養(yǎng)及共質(zhì)體形成 YS19和YJ76共培養(yǎng)時,將培養(yǎng)至指數(shù)期的YS19與YJ76均調(diào)整到A600=0.6,分別按(10∶0)～(10∶10)的接種量比例轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中,但接種時總接種量保持一致(1%,體積分?jǐn)?shù)),培養(yǎng)48 h后,取樣測定A600。同時,將菌液滴加于血細(xì)胞計數(shù)板(1 mm×1 mm),番紅染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察共質(zhì)體成團(tuán)平均尺寸,并通過顯微計數(shù)法測定共質(zhì)體的成團(tuán)率(參與成團(tuán)的菌體細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例)[24]。此外,將YS19和YJ76-GFP按10∶3接種量比例接種培養(yǎng)48 h后,取樣用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察共質(zhì)體結(jié)構(gòu)的形成。

1.2.4 抗逆性檢測 將YS19、YJ76以及共培養(yǎng)(YS19和YJ76菌株的接種量比例為10∶3)分別獨立接種到LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)48 h后,取樣分別進(jìn)行重金屬、抗生素、紫外線和干燥處理。檢測菌體對重金屬、抗生素的抗性時,培養(yǎng)基中分別加入化學(xué)品(終濃度為1.5 mmol/L ZnSO4;終濃度為40 μg/mL 四環(huán)素),培養(yǎng)4 h。將A600調(diào)節(jié)至0.6的菌液用PBS稀釋100倍,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中,在距離15 W紫外燈(波長254 nm)45 cm處,均勻照射30、60、90 s,檢測菌體對抗紫外照射能力,在10 mm×10 mm無菌濾紙片上分別滴加50 μL菌液,無菌環(huán)境下干燥處理1、2、3 h,干燥結(jié)束后用PBS收集菌體,檢測菌體抗干燥能力。將處理完成的菌液用PBS稀釋并在LB平板上涂布培養(yǎng),培養(yǎng)完成后進(jìn)行菌落計數(shù),存活率定義為處理后的菌落形成單位(CFU)數(shù)量除以處理前的CFU數(shù)量[6],所有實驗三個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 YS19和YJ76不同接種量比例對協(xié)同生長特征的影響

首先觀察了YS19單獨培養(yǎng)時(YS19∶YJ76=10∶0)共質(zhì)體形成的狀況,發(fā)現(xiàn)在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后,YS19形成了大量共質(zhì)體結(jié)構(gòu)(圖1,YS19),成團(tuán)率為67.2%,成團(tuán)的平均尺寸為2.6 μm,菌液A600為1.87。相比之下,培養(yǎng)體系中存在一定量的YJ76可以顯著促進(jìn)共質(zhì)體的形成(圖1,(10∶1)～(10∶3))。顯微觀察發(fā)現(xiàn),當(dāng)YS19和YJ76兩個菌株接種量比例為10∶3時,對共質(zhì)體形成促進(jìn)效果最顯著(圖1),統(tǒng)計學(xué)分析表明,在該接種量比例下共質(zhì)體成團(tuán)平均尺寸、成團(tuán)率均達(dá)到最高(圖2),與其他接種比例之間存在顯著性差異(P<0.05)。此時成團(tuán)率最大為79.2%,相較YS19單獨培養(yǎng)時增幅17.8%;成團(tuán)平均尺寸為4.7 μm,增幅80.7%;A600為2.38時,增幅27.3%。隨著YJ76添加比例的增加,對共質(zhì)體形成的促進(jìn)作用逐步弱化(圖1,(10∶4)～(10∶6),圖2),最后表現(xiàn)為抑制作用(圖1,(10∶7)～(10∶10),圖2)。當(dāng)兩個菌株接種量比例達(dá)到10∶9時,成團(tuán)率為42.6%,相較YS19單獨培養(yǎng)時降低36.6%;成團(tuán)平均尺寸為1.6 μm,降低38.4%;A600為1.7,降低9.0%。

圖1 顯微觀察YS19與YJ76不同接種量比例共培養(yǎng)對共質(zhì)體形成的影響Fig.1 Micrographic observation on the effect of co-cultivation with different inoculation ratios between YS19 and YJ76 on symplasmata formationYS19∶Δzwf=10∶3表示YS19與YJ76突變株Δzwf的接種量比例為10∶3YS19∶Δzwf=10∶3 indicates that the inoculation ratio of YS19 and YJ76 mutant Δzwf is 10∶3

圖2 YS19與YJ76不同接種量比例對共質(zhì)體成團(tuán)率、平均尺寸和A600的影響Fig.2 The effects of different inoculation ratio of YS19 and YJ76 on the symplasmata formation ratio, average size and A600 標(biāo)準(zhǔn)差用圖中的誤差線表示(n=3, P<0.05),下圖同The standard deviation is represented by the error bars in the figure (n=3,P<0.05), the same as in the figure below

2.2 吲哚產(chǎn)量減少的YJ76突變體Δzwf對共培養(yǎng)促進(jìn)作用的影響

考慮到前期研究中發(fā)現(xiàn)吲哚對于YS19共質(zhì)體形成有顯著促進(jìn)作用[25-26],本研究利用吲哚產(chǎn)量顯著下降的YJ76突變株Δzwf進(jìn)行了相同的分析(圖1,YS19∶Δzwf=10∶3;表1),以探究吲哚的產(chǎn)生在兩個菌株共培養(yǎng)時對共質(zhì)體形成發(fā)揮的作用。將YS19與YJ76突變株Δzwf以10∶3的接種量比例共培養(yǎng)48 h后,發(fā)現(xiàn)YS19的成團(tuán)率為63.7%,相較于YJ76野生株共培養(yǎng)時減幅19.6%;成團(tuán)平均尺寸為3.2 μm,減幅31.9%;A600為1.93,減幅17.9%,表明由Δzwf基因突變造成吲哚產(chǎn)量下降,相比YJ76野生株兩個菌株共培養(yǎng)時促進(jìn)YS19共質(zhì)體形成的效果,受到了顯著抑制。

表1 YS19與YJ76突變株Δzwf共培養(yǎng)對共質(zhì)體成團(tuán)率、平均尺寸和細(xì)菌生長的影響Table 1 Effect of co-cultivation of YS19 and YJ76 mutant Δzwf on symplasmata formation rate, average size and bacterial growth

2.3 YJ76參與YS19共質(zhì)體的形成

將YS19和YJ76-GFP兩個菌株共培養(yǎng)后,使用LSCM明場觀察發(fā)現(xiàn)菌體形成了大量的共質(zhì)體結(jié)構(gòu)(圖3A),而在暗場觀察發(fā)現(xiàn)許多GFP熒光標(biāo)記的YJ76菌體細(xì)胞(圖3B)。明場和熒光暗場重疊的結(jié)果顯示,共質(zhì)體并非僅由單一菌株形成,而是YJ76顯著參與到Y(jié)S19的共質(zhì)體中,兩個菌株的菌體細(xì)胞相互交織在一起(圖3C),表明這兩種植物內(nèi)生菌在共同的棲息環(huán)境中,產(chǎn)生了實質(zhì)性相互作用,從而形成了雜合共質(zhì)體。

圖3 CLSM觀察YS19與YJ76-GFP形成的雜合共質(zhì)體Fig.3 CLSM observation of hybrid symplasmata formed by YS19 and YJ76-GFP明場(A)、暗場(B)與兩場重疊(C)下的共質(zhì)體進(jìn)行比較;YJ76-GFP顯綠色熒光Hybrid symplasmata in the bright field channel (A) and fluorescent field channel (B) were compared with that in overlapping of the two field (C);YJ76-GFP showed green fluorescence

2.4 YS19和YJ76共培養(yǎng)對菌體抗逆能力影響

為了探究YS19和YJ76共培養(yǎng)促進(jìn)共質(zhì)體形成對菌體抗逆境生存能力的影響,本研究選用了四種逆境處理方式：重金屬、四環(huán)素、紫外線和干燥。研究發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)相較YS19單獨培養(yǎng)抵抗重金屬Zn2+、四環(huán)素逆境脅迫的能力分別提高了63.9%、56.0%;相較YJ76單獨培養(yǎng)抵抗重金屬Zn2+、四環(huán)素逆境脅迫的能力分別提高了147.9%、172.7%(圖4A)。相同的促進(jìn)效果同樣發(fā)現(xiàn)在紫外線照射研究中,處理90 s時檢測,兩個菌株共培養(yǎng)存活率較YS19單獨培養(yǎng)提高了57.4%,而兩個菌株共培養(yǎng)較YJ76單獨培養(yǎng)提高了266.3%(圖4B)。同樣,對于干燥處理,兩個菌株共培養(yǎng)也能顯著促進(jìn)菌體的存活率,處理3 h后檢測,兩個菌株共培養(yǎng)存活率較YS19單獨培養(yǎng)提高了72.0%,而兩個菌株共培養(yǎng)較YJ76單獨培養(yǎng)提高348.6%(圖4C)。

圖4 YS19、YJ76和共培養(yǎng)菌經(jīng)過化學(xué)物質(zhì)(A)、紫外線(B)和干燥(C)處理后的存活率Fig.4 Survival rate of YS19, YJ76 and co-culture solution after chemical (A),ultraviolet (B) and drying (C) treatments

3 討 論

在自然生長環(huán)境或培養(yǎng)基中,成團(tuán)泛菌能夠主動聚集成團(tuán)形成獨特的共質(zhì)體結(jié)構(gòu)[6],這一結(jié)構(gòu)的形成能顯著提高菌體在逆境中的生存能力,本實驗室以及其他學(xué)者的研究都發(fā)現(xiàn)成團(tuán)泛菌在植物體內(nèi)定殖時,幾乎全部以共質(zhì)體形式存在[11-12,27-28]。本研究從菌體共培養(yǎng)(模擬棲息)和共質(zhì)體結(jié)構(gòu)形成兩個角度探究了兩菌互作對抗逆的影響。

首先證實了P.ananatisYJ76參與P.agglomeransYS19共質(zhì)體的形成,正如前期本實驗室研究發(fā)現(xiàn),YS19在形成共質(zhì)體時并非由單個細(xì)胞發(fā)育而來(即所謂單克隆體系),而是多個單細(xì)胞主動聚集的結(jié)果,本研究觀察到的現(xiàn)象進(jìn)一步印證了上述結(jié)果,因為如果共質(zhì)體的形成起源于單克隆體系,則在YS19共質(zhì)體中不可能觀察到Y(jié)J76細(xì)胞。另外,適量的YJ76能夠促進(jìn)YS19共質(zhì)體的形成,本研究又通過YJ76吲哚產(chǎn)量大幅減少的突變株Δzwf與YS19共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)共質(zhì)體的成團(tuán)率以及尺寸有不同幅度的縮減。相關(guān)研究表明,吲哚信號能夠促進(jìn)YS19釋放eDNA和胞外多糖,而這兩種物質(zhì)存在于共質(zhì)體內(nèi)并在促進(jìn)共質(zhì)體穩(wěn)定性中發(fā)揮了重要作用[29-30],結(jié)合本研究的結(jié)果,可以推定YJ76對YS19共質(zhì)體形成的促進(jìn)作用是由于YJ76產(chǎn)生的吲哚信號造成的。而在較高的YJ76接種量比例下,共質(zhì)體的形成受到了抑制,這是由于過多的YJ76接種量使YS19的絕對量減少造成的。

本研究還發(fā)現(xiàn)YS19、YJ76共培養(yǎng)能顯著提高兩個菌株對逆境(重金屬Zn2+、四環(huán)素、紫外線以及干燥)的抵抗能力。在宿主水稻體內(nèi)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)中,YS19與YJ76兩個菌株占有菌體數(shù)量上的絕對優(yōu)勢,本研究結(jié)果表明在合適的共培養(yǎng)條件下兩個菌株能夠產(chǎn)生協(xié)同作用,提升了菌體抵御逆境的能力。這種協(xié)同效應(yīng)很可能是源自于兩個菌株具有的互補(bǔ)效應(yīng)[31]以及吲哚這一能夠發(fā)揮重要作用的種間信號分子的調(diào)控作用。也就是說,面對復(fù)雜多變的自然環(huán)境,兩個菌株甚至多個菌株的微生態(tài)體系具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。從本研究結(jié)果來看,對同一植物分離的內(nèi)生菌的微生態(tài)體系開展多菌的聯(lián)合培養(yǎng)研究對于探索內(nèi)生菌的相互作用乃至菌肥開發(fā)和利用具有科學(xué)意義。