合成生物學技術在環境保護中的應用

黃 磊, 高國輝, 馬佳駿, 羅澤天, 齊 玉

(天津理工大學 化學化工學院, 天津 300384)

根據世界衛生組織最近的一份報告顯示,環境風險因素導致約25%的人類死亡,相當于每年死亡1 260萬人[1]。各種類型的環境污染物往往分布廣泛,難以識別和定位,合成生物學技術有望為環境中的污染物監測和有效、有針對性地修復提供新的可能[2]。地球上人類的工業活動、石油泄漏、無節制地使用塑料以及電子廢物等有害物的填埋都導致了各類污染物的大量釋放,如多氯聯苯(PCBs)、多環芳烴(PAHs)、揮發性有機物(VOCs)和多溴聯苯(PBBs)等。持久性有機污染物(POPs)由于被固體顆粒吸附的速度比其溶解在水中的速度更快,因此可能通過有毒的農副產品進入我們的食物鏈和衛生系統[3]。另外,全球人口的不斷增長,對糧食的需求不斷提高,也強化了修復受污染場地的重要性[4]。合成生物學是將工程、科學和技術應用于編輯生物體的遺傳物質,進而執行新的功能的一門學科[5]。這可以為應對當前環境挑戰提供強有力的解決方案。規律間隔成簇短回文重復序列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats,CRISPR)技術在基因工程細菌和古細菌的生物修復中得到了廣泛應用,生物修復領域也出現了很多新的先進技術,包括生物膜工程、人工微生物群落的構建、基因驅動、酶和蛋白質工程等。生物修復中基因工程微生物的環境安全問題是這一領域研究的關鍵,包括基因工程微生物與本土微生物群落的基因水平相互作用、對非目標微生物群落的選擇壓力以及抗生素抗性基因的意外擴散等[6]。

1 基因工程中的合成生物學工具

建立一個基因工程系統需要一個合適的底盤細胞和基因編輯工具來控制和監測基因的重組。在合成生物學技術的幫助下,生物修復的最新趨勢是應用非模式化生物作為宿主,利用CRISPR作為基因編輯工具,生物遺傳電路作為工程化工具,來去除環境中的污染物[7]。根據代謝途徑的可行性和實驗室實驗的便利性,微生物可以被分為模式和非模式生物兩種類型,其中第一類是大多數合成生物學工作優先考慮的對象。然而,非模式生物由于其具有獨特的基于代謝途徑、碳源利用和對極端環境天然抗性的選擇性污染物降解能力,近年來在生物修復研究中得到了廣泛關注。盡管由于基因組GC含量高給非模式生物的基因改造帶來了相當大的限制,但科學界通過發現和開發新的遺傳組分 (如報告基因、穿梭載體、核糖體結合位點和啟動子),成功地解決了一些物種的相關問題[8]。本文后續將討論用于生物修復的合成生物學工具的具體類別,包括基因驅動和CRISPR工具,生物遺傳電路,酶和蛋白質工程以及一些新的生物修復技術。

1.1 基因驅動和CRISPR工具

基因驅動是一種新的可用于大規模污染的生物修復策略,它可以使特定的優勢基因在整個微生物群落或單個物種中擴散[9]。之前,石油衍生物污染地點的生物修復主要應用水平基因轉移技術,主要是通過接種攜帶有效降解基因(alma、xylE、p450cam)的大腸埃希菌(Escherichiacoli)到被污染的沉積物中。因為沒有外來物種干擾生態系統的風險,所以將降解基因轉移到原位微生物群落中是可行的。這使得原位微生物群落獲得了相關的降解基因,進而去除了石油烴類物質[10]。

有多種基因編輯技術可以作為人工分子剪刀在特定位點切割DNA,包括TALEN、ZFN和CRISPR。其中CRISPR技術應用于細菌系統是最有效和直接的。它最顯著的優勢是能夠應用于多個位點,并且高效地實現常見的基因工程目的,包括插入、刪除、替代和位點突變[11]。CRISPR工具包主要應用于假單胞菌(Pseudomonas)和大腸埃希菌等模式微生物。目前,其應用也已擴展到非模式生物,如橡膠紅球菌 (Rhodococcusruber)TH、睪酮單胞菌(Comamonastestosteroni)和無色桿菌(Achromobactersp.)HZ01[6]。天津理工大學化學化工學院生物化工課題組(本課題組)也應用CRISPR技術對芽胞桿菌屬(Bacillus)進行了改造,以期提高芽胞桿菌未來的應用潛力[12-13]。最近,又開發出多種基于CRISPR技術的極端微生物基因修飾系統,包括嗜熱菌、嗜酸菌和嗜鹽菌,這些系統可以在利用微生物進行生物修復研究中發揮關鍵作用[14]。CRISPR也被應用于產生物表面活性劑的微生物,以提升其降解芳香烴和農藥的生物電動力學修復系統效率[15]。

CRISPR干擾(CRISPRi)這種工程學工具,可以通過下調不利基因的表達,調節相應的代謝通量來過表達所需的目的產物[16]。相反,CRISPR激活(CRISPRa)工具可以使生物體能夠上調所需的目的基因[16]。例如,DeLorenzo等[17]報道了CRISPRi工具的應用,在非模式木質纖維素分解細菌渾濁紅球菌(Rhodococcusopacus) PD630中構建了第一個靶向基因表達抑制系統。

總的來說,CRISPR在生物修復中的應用很廣泛,但其在增強生物去除、抗逆性和優化生物降解途徑方面的研究較少,值得未來進一步關注。CRISPR技術在生物修復中的早期應用之一是靶向基因的敲除和導入,這有助于研究人員驗證特定基因的作用和功能。在Gallo等[18]最近的一項研究中,通過使用Thermo-Cas9工具進行靶向基因敲除證實了亞砷酸鹽抗性基因(TtarsM)對嗜熱細菌(Thermusthermophilus) HB27解毒系統的作用。這些靶向基因敲除方法也可以提高非模式生物中CRISPR工具的編輯效率,進一步為CRISPRi和CRISPRa以及多重基因組編輯進行代謝途徑改造提供了可能[19]。

目前一些研究表明,應用CRISPR技術可以通過生物轉化的方式將一些工業廢物轉化為高附加值產品。在針對木質纖維素的生物轉化過程中,科學家引入了一種基于CRISPR的過表達木質素分解酶蛋白的工程技術[20]。另一個受益于CRISPR的生物轉化領域是將CO、CO2和CH4(也稱為C-1氣體)等溫室氣體發酵生成各種附加值產品。許多產醋酸菌的大規模應用都受到其生長速度和一碳氣體產量低的制約,最近CRISPR介導的基因編輯技術顯示出克服這一限制的可能性。永達梭菌(Clostridiumljungdahlii)和石灰真桿菌(Eubacteriumlimosum)是兩種主要進行CRISPR介導基因編輯的產乙酸菌[21]。例如,在永達梭菌中利用兩個啟動子(Pthl、ParaE)表達Cas9和sgRNA并刪除4個基因(pta、adhE1、ctf和pyrE),這樣既提升了菌株的生長速度也促進了C-1氣體發酵生成乙酸和乙醇[22]。將CRISPRi工具箱應用于永達梭菌還可以增強溫室氣體發酵產丁酸的效率并減少相關碳源進入產乙醇支線途徑的量[23]。

由于序列與目標位置相似,因此會導致在不需要的位置發生DNA切割,這種現象稱為脫靶,脫靶也是CRISPR基因修飾廣泛應用的主要挑戰之一[24]。在開發基于CRISPR基因驅動的生物修復時要注意這部分情況,防止對自然生態系統產生不良影響。目前為止,為了確保CRISPR基因工程和基因驅動的安全性,全世界范圍已經開發了許多相應策略(表1)。

包括國家圖書館在事業發展、資源建設、信息組織、服務創新、技術應用、管理體制改革以及國家數字圖書館建設等方面的歷程與新的實踐經驗，并為其未來發展探討思路、提供參考借鑒。

表1 針對工程物種的生物安全方法

1.2 遺傳電路

遺傳電路類似于普通電路,主要由以下幾種分子基因設計和構建,包括報告基因、代謝基因、啟動子、復制子和選擇性標記。這些元件可以用來改變細胞行為,提高代謝產量或監測后續的代謝活動。構建合適的遺傳電路最重要的是選擇合適的遺傳元件。例如,缺乏報告系統和可誘導的啟動子會降低產乙酸工程菌利用空氣污染物轉化為附加值產品的能力。因此,對于遺傳重組,表征新的和有效的遺傳組分是至關重要的[20]。例如,耐重金屬貪銅菌 (Cupriavidusmetallidurans) CH34是一種多用途化能自養微生物,可用于芳香族化合物的降解、廢水生物發電和貴金屬的生物礦化。開發高效的可誘導或組成型啟動子有助于控制蛋白質生產和優化CRISPR編輯效率[26]。

遺傳電路的應用也可以與CRISPRi相結合來建立轉錄邏輯門,通過電路輸出結果來控制細胞行為,如糖分消耗等[26]。目前,在乙酸菌中已經成功實施這一策略,這樣可以將代謝活動與環境變化聯系起來,例如考察pH的改變與底物生長濃度變化的關系等[21]。

1.3 酶與蛋白質工程

復雜結構環境污染物的生物處理,如紙漿廢水中的木質素、農藥、芳香烴和塑料,都依賴于微生物降解酶的強大活性。然而,這些酶的自然產量不足,但可以通過遺傳操縱增強酶的表達量[27]。目前,很多工具被用于基因工程生物修復系統酶的優化,包括理性、半理性設計和定向進化[20]。通過替換活性部位中的官能團對羧化酶進行合理的重組,可將一種劇毒的苯酚衍生物(4-羥基苯乙烯)的生物降解率提高40%,同時將立體異構選擇性提高39倍[28]。另一方面,定向進化是一種基于隨機突變的非結構性方法,已經發展出許多新功能,例如測定生物修復應用的真菌木質素分解酶的極端pH抗性[20]。在酵母細胞中建立甲基化合成功能的最好方法是在過氧化物酶體中定向表達蛋白質,這在甲基化微生物的生物碳捕獲過程中尤其重要,特別是在消耗甲醇的酵母中,如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)[29]。 除上述方法之外,當具有污染物降解能力的基因在微生物宿主中表達時,重組DNA和異源表達技術也可以用于大規模酶的生產和純化,通過定點誘變方法,底物的活性和范圍得到了改善[30]。對不可培養環境樣本的宏基因組分析也有助于研究人員發現編碼具有特定功能的降解酶的新基因[30]。

1.4 優勢突變的快速篩選與選擇

采用實驗室適應性馴化(ALE)技術,建立了一種新的快速鑒定有益突變體的篩選方法。這可以促進后續的逆向工程和構建高污染物耐受性降解菌株的發展。傳統意義上,全基因組測序是在菌株逐步適應有毒物質或次生長條件后進行的,以揭示菌株的遺傳變化[31]。然而,在ALE期間多重突變的出現使得定位突變基因變得困難且耗時。應用快速優勢突變篩選與選擇(RAMSES)方法,在指數生長期向培養物中加入突變的DNA會導致DNA通過等位基因的置換而摻入染色體中,然后在增加選擇壓力的情況下進行突變株的篩選,此時只有優勢突變株才能生長[32]。一些科學家利用這種方法來表征木質素降解菌(Acinetobacterbaylyi) ADP1在暴露于高濃度阿魏酸鹽(一種木質素衍生芳香化合物)后的有益突變。他們進一步用有益的突變(基因hcaE、hcaK)來改造細菌,以提高其對阿魏酸鹽的耐受性[32](圖1)。

圖1 貝利不動桿菌ADP1中可能的芳香酸轉運系統示意圖[32]Fig.1 Schematic of possible aromatic acid transport systems in Acinetobacter baylyi ADP1[32]藍色：轉運體;綠色：孔道蛋白。虛線箭頭表示多個步驟blue： transporters; green： porins. The dashed arrow refers to multiple steps

2 生物修復應用方面的最新成就

生物修復研究工作始于基本的原位修復技術,如生物強化、生物隔離、生物通風,以及非原位方法,如堆肥、土地耕作、生物堆填和生物反應器[8]。這些方法主要應用于一些未改造的生物體,進而減輕相應的環境污染程度。后續研究人員開始評估新的天然生物酶、分離不同的微生物,并且運用簡單的基因編輯方法進行生物改造。目前采用合成生物學新技術(如生物膜工程及合成微生物群落)已經成功突破了生物修復屏障。

2.1 生物膜工程

生物膜工程是生物修復領域的一項最新發現,該技術旨在減弱有毒金屬、烴類化合物及農藥在自然界中的影響并進而克服天然生物膜的局限性。合成生物膜主要通過整合信號通路、代謝途徑工程及胞外聚合物(EPS)重排設計完成[33]。生物膜的再生能力使其能夠可持續利用,EPS組成的可控性使其能夠滿足各種生物修復的目的。生物浸出(從固體基質中溶解重金屬)、金屬腐蝕抑制及利用微生物燃料電池(MFC)處理廢水是一些傳統的生物修復應用,而生物膜工程可以對其做進一步的改進。例如,建立選擇性汞解毒系統,其中汞檢測器(MerR啟動子)會在大腸埃希菌中組成型表達。然后,通過一種名為Curli的合成納米纖維動態隔離游離的汞[34]。此外,通過用稀土結合標簽修飾的Curli纖維,可以制備對稀有元素(Tb3+)具有選擇性吸附能力的功能性生物膜[35]。這些研究說明了如何利用工程化生物膜從廢水和固體廢物中選擇性地回收重金屬。未來合成生物膜的環境研究方向包括更大規模的試驗、響應電路的優化、將相關研究從蛋白質研究擴展到其他生物膜成分(如多糖和核酸)上[33]。

2.2 合成微生物群落

通過在人為選擇的微生物群落中找到所需的優良性狀,可以極大地提高生物修復水平[36]。合成微生物群落包括具有預期性質的特定菌株的共同培養,在這種設定中,每個微生物都可以部分參與降解途徑。因此,可以避免單一菌株的過度工程化及其相關的代謝負擔。Jia等[37]成功構建了一個雙基因工程菌群落,其中大腸埃希菌HY1被接入4個表達菲雙加氧酶的基因,而銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PH2中導入一個高效的兒茶酚雙加氧酶基因,使兩株菌各自負責菲降解途徑的一部分,從而共同降解目標污染物,這與單獨培養相比,共培養體系有利于菌株的長期共存,對菲的去除效率更高。此外,了解微生物群落成員之間的合作效應可以為發現新的酶和生物降解途徑開辟道路,從而實現更高效的污染物去除[38]。

如何保持微生物群落結構在生態學和進化上的穩定性是該領域急需解決的問題之一。最近Schlembach等[42]引入了各種在線和離線監測以及控制混合培養動態的測量技術。例如應用繁殖體策略來評估兩個人工構建的細菌群落的可重復性及功能穩定性[43]。最近也有綜述總結了用于工程化合成微生物群落的可用工具包,包括群體感應信號分子、誘導劑及共養相互作用[44]。

最近在共培養方法上改進的空間連接微生物群落(SLMC),為建立具有不相容生理需求的合成微生物群落提供了可能 (例如嗜酸菌與嗜堿菌、需氧菌與厭氧菌的共培養),而這是使用傳統技術不可能實現的。SLMC涉及到的是工程化培養環境,而不是微生物菌株本身,并在互聯模塊內共同培養不同種類的微生物[45]。SLMC使不相容菌株之間的代謝物可以進行交換,并在選擇微生物群落組成方面提供了更大的靈活性。然而,控制每個模塊和通量交換中的群體大小仍具有挑戰性,并且限制了該技術的進一步應用[45]。

2.3 土壤的生物修復

土壤修復的物理和化學途徑包括土壤挖掘和溶劑清洗,而這可能會破壞土壤微生物菌群結構、養分循環和有機質儲存,進而對土壤質量產生負面影響[46]。因此,生物修復作為一種低成本、省人力、省能源、無二次污染的治理方法推廣就顯得尤為重要。主要土壤污染物生物修復的最新趨勢見表2。

表2 用于土壤生物修復的基因工程微生物

2.3.1 重金屬的去除 有多種方法可以減輕重金屬對環境的威脅,其中可持續性、環境友好的選擇包括生物淋濾(萃取和溶解)、生物吸附、生物還原(納米顆粒生物合成)、生物礦化(沉淀和固定)、植物修復等。也有一些新型的方法,如綁定多肽和鐵載體應用[67]。但所需時間較長而且金屬去除率不足限制了這些工藝的大規模應用。因此,合成生物學家開始通過修飾活的有機體系統來應對這些挑戰[68]。提高生物修復菌株對重金屬的耐受性是提高處理速度和效率的常見做法,其中提高耐受性的方法之一是插入重金屬抗性基因。Li等[69]在大腸埃希菌中表達豆梨中的植物螯合素合酶基因PcPCS1,使大腸埃希菌能耐受200 μmol/L的Hg2+,且能夠在100 μmol/L的含Hg2+培養基中正常生長。相比于野生型大腸埃希菌只能積累0.49 mg/g的Hg2+,轉PcPCS1基因的大腸埃希菌對Hg2+的積累量增加到了0.82 mg/g。最近也發現了幾種提高微生物對銅耐受性的工程化策略[70]。而對酸硫桿菌屬(Acidithiobacillusspp.)來說,尋找基因重組所需的合適遺傳元件是非常重要的。一種已經確定了監測基因表達和調控方法的高效報告基因,可應用于所有酸性硫桿菌[71]。此前,研究人員曾應用遺傳工具尋求其他類型的微生物底盤細胞,如異養菌、藍藻和甲烷氧化菌[50]。合成生物學工具在金屬的生物回收中的應用尚處于起步階段。上述微生物過程的進一步改進可以為綠色有效的修復金屬污染和從電子廢物等危險固體廢物中回收金屬提供新的可能。

2.3.2 烴類化合物的降解 合成生物學對烴類化合物生物修復的影響越來越大。烴類化合物包括多環芳烴、石油及其衍生物、六氯環己烷(HCH)、芳香族染料、氯代烷烴、多氯聯苯和有機鹵化物[72]。通過轉基因技術促進多環芳烴等化合物的生物降解策略包括：在基因表達調控的基礎上,尋找相關生長與降解基因以及與降解相關的酶基因,提高生物催化劑的活性,并構建新的降解途徑[73]。最近,合成生物學工具已成功用于操縱大腸埃希菌中的基因表達,并優化芳香族污染物的生物修復以及硝基烷烴氧化酶(NOE)在兩個嗜熱細菌中的同源和異源過表達[74]。另外,Wang等[75]在大腸埃希菌BL21中重建了苯酚完全生物降解的人工代謝途徑,其中苯酚被苯酚羥化酶降解為兒茶酚,然后通過環裂解轉化為粘康酸,最后在三羧酸(TCA)循環中徹底分解。本課題組目前主要以已篩選得到的苯系物高效降解菌為底盤細胞構建多環芳烴降解通路并提高其耐鹽能力,使其能夠應用于混合污染鹽漬化土壤的生物修復[76-77]。能夠降解聚氨酯(PU)的微生物包括假單胞菌、芽胞桿菌、不動桿菌、棒狀桿菌(Corvnebacterium)等細菌和曲霉(Aspergillus)、擬青霉(Pestalotiopsis)、枝孢霉(Cladosporium)、鐮刀菌(Fusarium)、青霉菌(Penicillium)等真菌,其中曲霉菌在PU解聚中顯示出最強大的能力[78]。導致PU分解的微生物酶主要有水解酶(蛋白水解酶)、酯酶、尿酶和酰胺酶。

2.3.3 塑料的降解 塑料的微生物降解是一個酶促過程,目前已經分離篩選得到多種降解塑料的微生物,包括放線菌、藻類、細菌和真菌[79]。合成生物學中的不同方法如宏基因組學、克隆和計算方法等都已被用來增強假單胞菌屬、埃希氏菌屬和芽胞桿菌屬物種在塑料酶促解聚中的能力[79]。塑料生物降解的大多數工程研究都集中在修飾編碼有效降解酶基因上,假單胞菌是細菌宿主克隆有效降解酶方面研究最多的菌株之一[80]。然而,非細菌宿主最近也吸引了研究者的注意力。聚對苯二甲酸乙二醇酯因其具有較強的解聚性和難水解性,是近20年來生物修復研究者研究最多的塑料。一項新的研究報告表明通過在遺傳宿主中表達阪崎氏菌(Sdeonellasakaisis)中的一個關鍵酶(PETase),實現了三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)作為藻類遺傳宿主成功在低成本生長條件下將聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解(圖2a)[81]。最近,對角質酶的熱穩定性和活性的研究促進了PET的降解,使其生物降解率超過了90% (比以前發現的酶高出33倍)[82]。可以通過分子對接和結合模式分析確定氨基酸殘基的突變,從而提高酶的催化活性。為了解釋來自垃圾填埋場裂解聚醚-聚氨酯(PE)-PU塑料的微生物群落的作用機制,Gaytán采用了一種新的結合物理和化學分析手段的元基因組方法(基于就近連接)(圖2b)[83]。研究結果揭示了每個物種的降解基因和降解酶,為了解每個物種如何增強和促進塑料的生物降解提供了新的思路。最近,Carr等[84]也提供了在本土菌群中確定的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)水解酶的清單。

圖2 合成生物學技術對塑料的降解Fig.2 Degradation of plastics by synthetic biology techniquesa：AP_SP-PETase-FLAG蛋白示意圖和PETase-GFP表達圖;b：BP8細胞培養后附著在聚醚-聚氨酯-丙烯酸酯上的掃描電子顯微鏡圖a：Schematic of AP_SP-PETase-FLAG protein, and PETase GFP expression diagram;b： Scanning electron microscopy image of BP8 cells attaching to olyether-polyurethane-acrylate after cultivation

2.3.4 農藥的降解 近年來,人們應用了不同的策略來提升農藥的生物修復效率,一般把重點放在人工選擇微生物群落上,利用適應性基因丟失、代謝負荷分解、酶工程和群體感應來加強殺蟲劑的去除。Li等[85]開發了一種合成微生物群落(PSC-1)來有效降解七種持久性農藥：毒死蜱、吡蟲啉、多菌靈、百菌清、λ-氯氟氰菊酯、β-氯氰菊酯和溴氰菊酯[86]。有機磷化合物(OPCs)是廣泛分布的一類殺蟲劑,在最近的一項研究中,設計了一種有機磷酸酯水解酶(OPH)來改善OPCs的降解。定點突變可以提高OPH水解酶的立體異構選擇性。蛋白質融合、固定化和化學修飾等工程方法可以提高其催化性能、酶穩定性和底物親和力[87]。在某些情況下,可以將一個完整的生物降解途徑導入到新菌株并整合進染色體中。Zhao等[88]采用一種新的構建生物降解途徑的策略,實現了γ-六氯環己烷(γ-HCH) (一種有機氯農藥)和1,2,3-三氯丙烷(一種有毒溶劑)的完全去除[88]。

3 展 望

環境中的污染物類型廣泛,往往難以識別和定位。開發新的、快速的、安全的并且具有成本效益的技術來消除它們是非常重要的。生物修復作為污染物去除技術已經非常成功,雖然一些微生物具有較好的降解能力,但由于污染物的持久性,仍然需要對這項技術進行進一步的優化改良。多年來,不同科學領域的進步帶來了各種降解技術的改進。系統生物學、分子工具和多組學的知識是合成生物學的基礎,它開創了生物修復的新時代。對經過基因和代謝優化的微生物進行分析、設計、構建和微調,可最大限度地降解污染物。

合成生物學技術的發展使得開發生物傳感器來檢測和監測污染物,了解微生物動力學來構建復合菌群以及創造新的代謝途徑或增強酶促作用成為可能。另外,仍然有必要進行更多的現場實驗,以支持在實驗室獲得的不同結果,并為工程化微生物進入環境建立必要的安全參數。生物修復的一個重要瓶頸是現有方法能夠降解的污染物范圍有限。此外,生物修復可能緩慢且低效,使其在某些應用中不切實際,而生物強化可通過將外源微生物引入到污染環境來幫助克服這些困難。宏基因組研究也有助于加速鑒定新酶和新的微生物。

盡管關鍵挑戰有待解決,但合成生物學仍有很大可能解決環境問題和限制環境危害,同時將其轉化為環境安全的物質。我們需要更加努力來加速從目前的傳統方法向合成生物學方法的過渡。隨著更多合成生物學方法的開發,期望設計更多的微生物來更有效地感知、量化和靶向特定的環境污染物。